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木瓜蛋白酶水解马铃薯蛋白工艺优化研究

来源:职称论文发表咨询网作者:田编辑时间:2021-02-03 09:31

  摘 要 马铃薯蛋白是马铃薯淀粉加工的副产物,由19种氨基酸组成,营养价值很高,可以有效预防胶原病及心血管系统的脂肪沉淀,具有重要的保健功能​‍‌‍​‍‌‍‌‍​‍​‍‌‍​‍‌‍​‍​‍‌‍​‍‌​‍​‍​‍‌‍​‍​‍​‍‌‍‌‍‌‍‌‍​‍‌‍​‍​​‍​‍​‍​‍​‍​‍​‍‌‍​‍‌‍​‍‌‍‌‍‌‍​。文章在单因素试验基础上进行正交试验,利用pH值、酶解时间、酶添加量、酶解温度四个条件研究了木瓜蛋白酶水解马铃薯蛋白的优化工艺。结果表明:pH值6.0、酶解时间3 h、酶添加量0.7%、酶解温度55 ℃为马铃薯蛋白酶解的最优条件,马铃薯蛋白的水解率为28.23%。

  关键词 木瓜蛋白酶;马铃薯蛋白;酶解;工艺优化

  马铃薯是我国重要的农产品之一,因其抗逆性强,在我国被广泛栽培,成为世界上仅次小麦、水稻和玉米的第四大粮食作物[1]。马铃薯蛋白是马铃薯淀粉加工的副产物,新鲜的马铃薯块茎中蛋白质含量为1.7%~2.1%,分为高分子蛋白质、糖蛋白、蛋白酶抑制剂三部分[2]。马铃薯蛋白属于完全蛋白质,是一种优质的植物蛋白源,在食品工业中具有广阔的应用前景,其氨基酸组成有19种,营养价值很高,能预防心血管系统的脂肪沉积,保持动脉血管的弹性,防止过早发生动脉粥样化,还可防止肝、肾中结缔组织的萎缩和胶原病[3-4]。马铃薯蛋白水解物是以马铃薯蛋白为原料,在酸、碱或酶的作用下,将马铃薯蛋白水解为小分子肽以及游离氨基酸,Asokan等[5]从马铃薯蛋白水解物中分离出2种多肽,利用鼠心成肌细胞(H9C2)作为肥大心肌体外模型。

  酶法水解马铃薯蛋白的研究,最初是利用酶降解部分蛋白质,增加其分子内、分子间交联或连接特殊功能基团,改变蛋白质的功能性质,以获得良好加工特性的研究[6-7]。目前,关于马铃薯蛋白水解工艺的研究,主要集中于单酶或多酶法[8]。高丹丹等[9]以马铃薯渣为原料,用木瓜蛋白酶水解马铃薯蛋白,通过优化最佳工艺,得到水解度为20.19%的产物。赵晶等[10]利用胰蛋白酶水解马铃薯蛋白,通过优化工艺条件,蛋白质水解度可达39.9%。张泽生[11]等利用三种酶KD1、KD2、KD3水解马铃薯蛋白,比较三种酶的水解度,通过优化工艺,得到KD3的水解度最高,水解度为48.794 %。本实验采用酶解法,以马铃薯蛋白为原料,采用木瓜蛋白酶水解马铃薯蛋白探究pH值、酶解时间、酶解温度和酶添加量对酶解效果的影响,并在此基础上进行正交实验,探究较佳的水解条件。

木瓜蛋白酶水解马铃薯蛋白工艺优化研究

  1 材料与方法

  1.1 材料和试剂

  市场选购马铃薯蛋白粉(纯度90 %,陕西斯诺特生物技术有限公司),木瓜蛋白酶(200 000 U/g,南宁庞博生物工程有限公司),中性蛋白酶(150 000 U/g,河南仰韶生化工程有限公司),碱性蛋白酶(200 000 U/g,河南仰韶生化工程有限公司),复合蛋白酶(150 000 U/g,安琪酵母股份有限公司),氢氧化钠、盐酸、邻苯二甲酸氢钾、硫酸、甲醛(分析纯,天津市百世化工有限公司)。

  1.2 仪器和设备

  AR224 CN型电子天平,奥豪斯仪器(常州)有限公司;L9型可见分光光度计,上海仪电分析仪器有限公司;FOSS全自动凯氏定氮仪,DenMark;HH-S4A型电热恒温水浴锅,北京科伟永兴仪器有限公司;GL21 M型高速冷冻离心机,赛默飞世尔科技(中国)有限公司。

  1.3 方法

  1.3.1 蛋白酶的筛选

  选用木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、复合蛋白酶进行水解酶的筛选。以厂家提供的商品最适pH值和温度,取5 g马铃薯蛋白,按照1 g蛋白添加1 000 U单位的酶水解3h[12],利用甲醛滴定法测定水解后的氨基态氮含量,并计算马铃薯蛋白的水解率,最终确定实验用酶为木瓜蛋白酶。

  1.3.2 马铃薯蛋白水解单因素实验

  (1)酶添加量对马铃薯蛋白水解度的影响

  称取5 g马铃薯蛋白粉溶于100 mL去离子水中,调整溶液初始pH值为6,分别加入0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%的木瓜蛋白酶,55 ℃水解3 h后,利用甲醛滴定法测定酶解液的水解度。

  (2)酶解时间对马铃薯蛋白水解度的影响

  称取5 g马铃薯蛋白粉溶于100 mL去离子水中,在溶液初始pH值为6,酶浓度0.5%的条件下,于55 ℃分别水解1 h、2 h、3 h、4 h、5 h后,利用甲醛滴定法测定酶解液的水解度。

  (3)酶解温度对马铃薯蛋白水解度的影响

  称取5 g马铃薯蛋白粉溶于100 mL去离子水中,在溶液初始pH值为6,酶浓度0.5%,分别于50℃、52.5 ℃、55 ℃、57.5 ℃、60 ℃条件下水解3 h后,利用甲醛滴定法测定酶解液的水解度。

  (4)pH值对马铃薯蛋白水解度的影响

  称取5 g马铃薯蛋白粉溶于100 mL去离子水中,分别调节溶液初始pH值为4.5、5、5.5、6、6.5、7,在酶浓度0.5%的条件下,55 ℃水解3 h后,利用甲醛滴定法测定酶解液的水解度。

  1.3.3 木瓜蛋白酶水解马铃薯蛋白的正交实验

  依据单因素实验的结果,选择酶添加量、酶解时间、酶解温度、pH值四个因素,以酶解马铃薯蛋白的水解率为指标进行正交实验[13],采用L9(34)的正交实验表,实验因素水平见表1。记录实验结果,使用SPSS和Origin2016 软件分析实验数据。

  1.3.4 数据测定方法

  马铃薯蛋白含量测定:凯氏定氮法[14]。

  式中:

  X :样品中蛋白质的含量(g/100 g)。

  V1:试液消耗硫酸或盐酸标准滴定液的体积(mL)。

  V2:试剂空白组消耗硫酸或盐酸标准滴定液的体积(mL)。

  C :硫酸或盐酸标准滴定溶液浓度(mol/L)。

  0.0140:1.0 mL硫酸[c(1/2H2SO4)=1.000 mol/L]或盐酸[c(HCl)=1. 000 mol/L]标准滴定溶液相当的氮的质量(g)。

  m:试样的质量(g)。

  V3:吸取消化液的体积(mL)。

  100:换算系数。

  酶解液中氨基态氮的含量测定:甲醛滴定法[15]

  式中:

  X :样品中氨基酸态氮的含量(g/ 100 mL)。

  V1:测定用样品稀释液加入甲醛后消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积(mL)。

  V2:试剂空白组加入甲醛后消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积(mL)。

  C:氢氧化钠标准滴定溶液的浓度(mol/L)。

  0.014:与1.00 mL氢氧化钠标准滴定溶液[c(NaOH)=1.000mol/L]相当的氮的质量(g)。

  V:吸取试样的体积(mL)。

  V3:样品稀释液的取用量(mL)。

  V4:样品稀释液的定容体积(mL)。

  100:单位换算系数。

  水解度计算[16]:

  水解度(%)=(氨基酸态氮/样品中总氮)×100。

  2 结果与分析

  2.1 筛酶实验结果

  由表2可知,利用不同酶水解马铃薯蛋白,计算其水解率,以马铃薯蛋白水解率为筛酶实验指标,研究发现,木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶和复合蛋白酶的水解率分别为29.61 %、11.66 %、14.18 %和19.28 %。因此本实验选用木瓜蛋白酶水解马铃薯蛋白。

  2.2 酶添加量对马铃薯蛋白水解率的影响

  由图1可知,当酶添加量在0.3%~0.8%之间时,水解率随着酶添加量增加而不断增加,当酶添加量达到0.6%时水解速率逐渐降低。其主要原因可能是随着酶解反应的进行,酶解产物过多阻碍了马铃薯蛋白和木瓜蛋白酶之间基团的结合,导致水解率下降。另外,随着反应增加水解产物浓度后会增加反应体系的黏性和产物抑制[17],从经济效益上考虑,选择0.6%酶添加量。

  2.3 酶解时间对马铃薯蛋白水解率的影响

  由图2可知,马铃薯蛋白的水解率随着水解时间的延长而不断增加,直到底物被水解完,水解率变为一个定值​‍‌‍​‍‌‍‌‍​‍​‍‌‍​‍‌‍​‍​‍‌‍​‍‌​‍​‍​‍‌‍​‍​‍​‍‌‍‌‍‌‍‌‍​‍‌‍​‍​​‍​‍​‍​‍​‍​‍​‍‌‍​‍‌‍​‍‌‍‌‍‌‍​。当酶解时间超过3 h后,水解速率呈现降低的趋势。其主要原因可能是随着酶解的进行,酶解产物不断增加,当酶解产物积累到一定量后会对木瓜蛋白酶产生抑制作用[18]。选择3 h为水解时间。

  2.4 酶解温度对马铃薯蛋白水解率的影响

  由图3可知,温度在50 ℃~55 ℃之间时,水解率呈增长趋势,在55 ℃时水解率达到最大;温度在55 ℃~60 ℃之间时,水解率呈下降趋势。可能是由于温度过高破坏了酶的非共价键结构,使酶的结构改变而失活,而温度过低导致内能不够,不足以支持酶和蛋白之间基团的集合,从而造成酶活力下降,进而影响马铃薯蛋白水解[19],因此选择55℃为水解温度。

  2.5 pH值对马铃薯蛋白水解率的影响

  由图4可知,pH值从4.5到6.0时,水解率随着pH值的升高而升高,pH值从6.0到7.0时,水解率随着pH值升高而下降,pH值为6的时候水解率最高,达到20.15%。其原因可能是木瓜蛋白酶分子上的结合基团受到极端pH值的影响而发生解离,导致底物无法与酶结合;或者是催化基团受到极端pH值的影响发生解离,导致底物无法被催化生成产物[20],所以呈现出先升后降的趋势,最终选择6.0为水解pH值。

  2.6 正交实验结果

  由表3中的R值分析可知,对于马铃薯蛋白质的水解率,A、B、C、D因素对木瓜蛋白酶水解马铃薯蛋白的影响次序是D﹥B﹥A﹥C。pH值是主要因素,酶解时间是一般因素,酶添加量和酶解温度是次要因素,较优组合为A3B2C2D1,即酶添加量0.7%、时间3 h、水解温度55 ℃、pH值6.0。选择该自由组合条件进行验证试验,得出在该条件下马铃薯蛋白的水解率为28.23 %,与正交试验中提取率最高的一组进行比较,可知马铃薯蛋白质的较佳水解条件为A3B2C2D1,即酶添加量0.7%、时间3 h、水解温度55 ℃、pH值6.0。此条件下马铃薯蛋白的水解率为28.23 %。

  2.7 结果分析讨论

  由表4可知,本次实验中用木瓜蛋白酶水解马铃薯蛋白酶的水解率不是很高,可能是因为酶的种类不同或者水解马铃薯蛋白的种类不同,导致水解效率有差异,不同的酶其分子的酶活性基团有差异,结合马铃薯蛋白或者解离马铃薯蛋白的能力各不相同,不同的马铃薯蛋白分子用于与酶结合侧链基团不同,直接影响了结合效率及水解效率[21-22]。

  3 结论

  本研究以马铃薯蛋白粉作为原料,利用木瓜蛋白酶研究水解工艺,以水解率为实验指标,对水解条件优化,最终水解较优条件为酶解温度55 ℃、酶添加量为0.7%、酶解时间3 h、pH值6.0,本研究优化了木瓜蛋白酶水解马铃薯蛋白条件,最终验证水解率高达28.23%。

  参考文献

  [1]赵晶,王雪飞,白扬.酶法水解马铃薯蛋白技术的研究[J].食品科技,2008(8):48-50.

  [2]刘素稳.马铃薯蛋白质营养价值评价及功能性质的研究[D].天津科技大学,2008.

  [3]潘牧,彭慧元,邓宽平,等.马铃薯蛋白的研究进展[J].贵州农业科学,2012,40(10):22-26.

  作者甘 雨1 李富贵1 马海锐1 王致远1 冉 权1 陶志东1 马娜娜1 丁功涛2


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