一种用于早期肺癌筛查的新型自身抗体芯片

　　摘 要：非典型增生腺瘤(Atypicaladenomatoushyperplasia，AAH)和鳞状细胞增生(squamouscelldysplasia，SCD)与肺部恶性损伤的发展有相关性，精确诊断 AAH 和SCD有助于早期确诊肺癌，同时有助于肺癌高危人群的筛查与早期干预。本项目利用免疫反应原理，将噬菌体展示技术与生物淘洗技术相结合，获得可表达肿瘤相关蛋白的噬菌体特异性文库，并将噬菌体点制在生物芯片上，筛选得到了与肺部损伤相关的特异性蛋白，经测序分析鉴定出多种自身抗体为恶性肿瘤相关蛋白。最终，通过数据分析，建立筛选分类器，制成筛查检测芯片，用于筛查 AAH 与 SCD，评估早期肺癌风险，表现出重要的临床诊断应用前景。

　　关键词：肺癌;吸烟;标志物;AAH;SCD;自身抗体

　　1 研究背景

　　肺部肿瘤是实体瘤发病率与死亡率中占比较大的病种，国家癌症中心的统计报告显示，全国恶性肿瘤发病第1位的是肺癌，每年新发病例约78.1万。在长期吸烟的人群中，导致肺癌的比例高达90%。特别是在中国，不断上升的吸烟人群数量导致的肺癌发病率持续上升。近年来，在肺癌治疗领域取得了越来越多的进展，证实了早期发现对于肺癌的成功治疗及生存期的延长至关重要。数据统计显示，经过手术治疗的所有1A 期非小细胞肺癌患者，5年生存率大约为80%。经过手术治疗的所有ⅠB期非小细胞肺癌患者，5年生存率大约为60%。Ⅱ期非小细胞肺癌，经过手术治疗的所有Ⅱ期非小细胞肺癌患者，5年生存率大约为40%-50%，而ⅡA 期，Ⅲ期，Ⅳ期的生存率则逐渐降低。因此，准确诊断早期恶性肺癌或早期恶性肿瘤的新技术对于提高患者生存率大有裨益。

　　非典型性腺瘤性增生(AAH)和鳞状细胞发育不良(SCD)分别被报道为肺腺癌和鳞状细胞癌的前体[1，2]。Wistuba和 Gazdar之前已经描述了由健康组织到肿瘤前病变和恶性疾病的进展过程[3]。简单来说，对于鳞状细胞癌，在染色体3p21和9p21上的杂合性丧失可能导致端粒酶功能障碍。细胞周期调控基因的DNA 甲基化，如p16INK4a，以及FHIT和 TP53等肿瘤抑制基因中的 LOH 进一步促进了上皮组织细胞生长的失调，最终导致了原位癌和转移性疾病。对于腺癌，主要是ras致癌基因的通路(吸烟者)或表皮生长因子受体通路(非吸烟者)基因的突变导致组织生长失调，最终导致腺癌。

　　目前应用最广泛的临床检测前肿瘤性肺 SCD 病变的方法包括：白光支气管镜(WLB)和自动荧光支气管镜(AFB)。Chen等人[4]回顾了492份论文和14项研究，共包含了适合进行meta分析的15个数据集，证实了 WLB和 AFB的敏感性和特异性，且最终都经组织学检测进行了验证。AFB的混合敏感性和特异性分别为0.90 (95% CI0.840.93)和0.56 (95% CI0.45-0.66)，而 WLB为0.66(95% CI0.58-0.73)和0.69(95% CI0.57-0.79)。因此，据报道 AFB在发现肺癌和肿瘤前SCD病变方面优于 WLB，然而这项技术对操作人员的技术需要较高，并且需要内窥镜插入人体肺部进行检测，属于侵入性检测，会造成患者的不适。

　　非典型增生腺瘤出现在肺实质组织周围，主要涉及进行气体交换的肺泡位置。非典型增生腺瘤造成的损伤经常是较小的、无症状的，射线下观察不到的，因此常常需要使用螺旋 CT以及外科手术后的组织活检作为诊断方式，并且该病常常会在不明确的区别点形成支气管肺泡细胞癌(BAC)[5]，临床目前根据损伤大小进行区别，小于等于5mm 的认为是 AAH，当大于5mm 时定义为 BAC/腺瘤。尽管有一些成功的方法可以筛查一些肺癌的高发人群，但是仅使用螺旋 CT在区别 支 气 管 癌、腺 癌、非典型增生腺瘤时仍然存在一定的难度，假 阳 性 率 约 为20-35%[6，7]。

　　除了这些具有侵入性的检测方式，以血液中的生物标志物为基础的检测方法引起了广大科研工作者的兴趣，检测与肿瘤相关抗原的血清抗体(TAAs)可以为早期癌症提供更可靠的诊断信息[8，9]。免疫系统的敏感性极高，可以检测到人体中少量肿瘤细胞通过大量激活 T 细胞而产生的 TAAs。据报道，自身抗体p53可在早期卵巢癌和结直肠癌患者体内检测到[10]，另外，应用血清自身抗体组合可以比放射检测法早5年检测发现非小细胞肺癌(NSCLC)[11]。30%的导管原位癌患者可以检测到原癌基因 HER-2/neu被过度表达的相应血清抗体[12]。因此，根据身体免疫系统这种自然的抗体倍增效应原理，通过检测抗体来检测病变前肺癌的方案是合乎逻 辑 的，也是切实可行的。本研究就是利用血清中存在的损伤特异性抗体来检 测AAH 和SCD肺损伤。这种方法是一种有效的、非侵入性的评价肺癌风险的方案。

　　2 方法与材料

　　2.1 研究人群

　　2012年-2016年间就诊于河北大学附属医院的1500例高危患者(年龄大于55周岁，每年吸烟大于25包)，患者血清取自治疗前，之后行支气管内窥镜及低剂量螺旋 CT 检测，并对不规则组织或者可疑组织进行活检，对于确诊 SCD 或者 AAH 的样本纳入本项研究，并从六个患者肺部取下三份SCD组织，三份 AAH 组织构建cDNA 文库。另外，收集600份血清，其中150份 AAH，150份SCD，300份正常对照样本。采用静脉采血的方法使用红色盖的采血管抽血，血液静置30min后，离心分离血清，分装后-80℃保存。表1列出血清的详细信息。

　　2.2 RNA提取及T7噬菌体构建

　　使用上述提到的组织分别构建 AAH 和 SCD 的 噬 菌 体 文 库。使 用 RNeasy MiniKit(Qiagen).试剂盒提取总 RNA，使用 OligotexDirectmRNA MiniKit(Qiagen)分离 mRNA，并测定 mRNA 浓度，调整浓度一致后，随机引物反转录成cDNA，加入2μLDirectionalEcoRI/HindIIILinker，在 T4DNA 连接酶的作用下16℃连接过夜。之后，分别加入 EcoRI和 HindIII各100U，37℃温育2h消化接头，得到两端分别有 EcoRI和 HindIII粘性末端的双链cD-NA。之后，连接进 T7噬菌体，通过噬菌斑测定，确定文库的滴度。

　　生物淘洗使用 AAH/SCD 及正常血清样本，为了去除非肿瘤相关蛋白，先使用正常血清与封闭的 G 蛋白珠反应，非特异性的噬菌体将结合在蛋白珠上，未结合的噬菌体再与 AAH 和SCD血清反应，之后将结合的噬菌体洗脱并富集，反复淘洗四次，获得 AAH/SCD 特异性噬菌体文库。反应的步骤按照 Novagen公司 T7SelectBiopanningKit说明书进行。四次淘洗之后的噬菌体感染细菌并在固体培养基上测定滴度。之后选择并确定合适的稀释度，以获得单克隆的噬菌斑，测试结果是稀释107-108时可以看到单克隆的噬菌斑。

　　为了确定生物淘洗富集的噬菌体的程度，将四次淘洗的结果分别在琼脂板上培养，形成1-4号培养板，并将板上的噬菌体转印到硝酸纤维素膜上，将 AAH/SCD患者血清与膜进行免疫反应，血 清 按1∶2000稀 释，之 后 加 HRP-标 记 的 二 抗，二 抗 以1∶1000稀 释，之 后 使 用ECL化学发光法进行检测。结果显示，从 BP1到 BP4反应活性噬菌体的量逐渐增加。另外，为了确定噬菌体的特异性，在 BP4上转印两张相同的硝酸纤维素膜，分别与 AHH/SCD 和正常人血清反应，之后加 HRP标记的二抗，用 ECL化学发光法观察结果。

　　2.3 高通量芯片筛选

　　通过四轮的生物淘洗，获得了4000个独立的噬菌体克隆，分别在96孔板上培养富集。每孔加入150μLE.coliBLT5615细胞，37℃ 培养3h，培养之后，取30μL上清转入384孔板，空噬菌体 T7文库也分别加到384孔板中，作为内对照。之后使用 Gesim 公司的 NP2.1型点样仪进行芯片的点制。

　　使用5份 AAH 和5份SCD 血清进行芯片反应，(以上10份样本应该为非制作噬菌体文库的血清样本)，兔抗 T7噬菌体的二抗用来作为内对照，血清用细菌培养基30倍稀释，T7抗体1∶3000稀释(用 TBST稀释)，室温反应1h，芯片冲洗后，与Cy-5标记的抗人抗体和Cy3标记的抗兔抗体反应，二抗分别稀释4000倍，室温反应1h，之后用 GenePix4000B扫描仪扫描，并用 GenePix5.0分析软件进行结果分析，并对Cy5∶Cy3的数据进行线性回归，对于比值高于两倍标准偏差的蛋白可以做为候选蛋白。

　　2.3 用诊断芯片进行血清样本检测

　　将400个筛选出的噬菌体克隆以及200个空噬菌体分别进行富集，之后点制在芯片上，制成诊断用芯片。使用50例 AAH，50例SCD 以及100对照，组成训练集，按上述方法进行检测，通过算法，获得分类器，之后再选择400份血清对分类器进行验证，包括100份 AAH，100份SCD，200份对照，检测后分别用 AAH 和SCD的分类器进行评估。最终结果与实际样本信息进行对比，统计敏感性与特异性。

　　2.4 数据分析与统计模型构建

　　用 Cy5中位数与 Cy3中位数的比值作为血清中噬菌体蛋白的表达值，为了平衡芯片间的差异，根据公式[(噬菌体蛋白 Cy5/Cy3)-(空 T7Cy5/Cy3)]/(空 T7Cy5/Cy3)对所得数据进行标准化处理。归一化之后的 Cy5：Cy3值作为每一个噬菌体克隆的数据进行统计，之 后 将AAH 样本和SCD样本，正常样本的数据在JMP统计软件上进行t-检验，选择 P值<0.01的蛋白做为候选标志物，并归集成不同的分类器。为了获得更准确的分类器模型，又使用 SAS统计软件进行了 LR 逻辑回归分析，对模型中的蛋白分别进行了权重计算，并且建立了 ROC曲线，形成一种最佳的疾病诊断模型。

　　2.5 测序鉴定

　　对于分类器筛选出的噬菌体的测序鉴定，使用的是商业化的噬菌体通用引物进行 PCR 扩增，上 游 引 物：5′-GGAGCTGTCGTATTCCAGTC-3′，下 游 引 物：5′-AACCCCTCAAGACCCGTTTA-3′。PCR产物纯化后测序，测序结果在 GeneBank数据库中进行 BLAST比对。3 实验结果3.1 生物淘选噬菌体文库使用 AAH 或者SCD患者的组织进行 T7噬菌体文库的构建，测定文库滴度，AAH 文库5.5×106，SCD 文 库3.8×106。经 过 PCR 检 测，结果显示噬菌体中插入的片段约为0.5-2kb，证明文库构建成功。

　　将以上两个文库混合，使用 AAH/SCD 及正常血清样本进行生物淘洗，筛选在噬菌体上表达的肿瘤相关抗原，使用患者血清作为基础抗体来源，免疫检测显示，反复多次的淘洗和噬菌体扩增，可以获得更大量的免疫反应噬菌体(图1)。以上免疫反应表明了噬菌体表面表达蛋白与病人血清中抗体的高亲和力。同时，相比之下，某些克隆与正常血清并未发生免疫反应，即这些克隆为病人特异性相关克隆，而正常血清也反应的克隆即为表达非特异蛋白的背景性噬菌体克隆。

　　图1中，为了确定生物淘洗的富集效果，淘洗结果展示在 LB培养基上，其中 BP4显示了比BP3更多的免疫反应性。举例说明了使用患者的血清连续富集可获得肿瘤相关抗体。为了验证富集的蛋白的特异性，用两个硝酸纤维素膜在 BP4的培养基上印一下，一个用 AAH/SCD血清反应，另一个用正常血清反应。多个免疫反应克隆在疾病组显示免疫特性，而正常组无反应。

　　3.2 高通量筛选

　　从 BP4的噬菌体文库中随机筛选出4000个噬菌体并点制在附有薄膜涂层的微阵列芯片上，之后用5个单独的 AAH 或 SCD 患者 血 清(非生物淘洗用样本)样本与芯片反应。根 据Cy5∶Cy3信号筛选出了238个 AAH 相关噬菌体，193个SCD相关噬菌体。再次筛选信号比大于2个标准差的噬菌体，作为诊断芯片构建的候选噬菌体。图2展示了 Cy5∶Cy3线性回归的结果。

　　噬菌体克隆点制在芯片上，检测患者血清样本，图2展示了部分 AAH 和 SCD 患者样本的芯片图，以及芯片扫描的荧光值对应的散点图。

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　　3.3 统计分析

　　通过高通量筛选，再次挑选出来400个免疫活性噬菌体，加上200空T7噬菌体，一起点制在芯片上制成诊断用芯片。点制多张芯片，分别用于评估50个 AAH 和50个SCD，以及100个对照正常血清样本，形成一个训练集。分别进行归一化，并统计400个噬菌体在正常血清和疾病血 清 中 的 Cy5∶Cy3比 值。通 过 T 检验获得每个蛋白的cut-off值。经 过 检 测，47 例AAH，39例SCD超过设定的cut-off值。

　　根据P值，收集前30个噬菌体克隆，进行组合，然后使用逻辑分析，选最优敏感性的回归算法，区分病人和正常人。通过测试，结果使用9种噬菌体，对于 AAH 最高预测敏感性可达92.3%，特异性90.2%。使用LOOCV(leave-one-outcross-validation)算法这些结果得到进一步验证，ROC曲线得到 AUC=0.874。因此，9个噬菌体蛋白质的组合在 AAH 中显示出最精确、稳定的分类效果。同样的方法在对SCD测试时表现出更好的效果，敏感性98.3%、特异性95.6%，同样使用 LOOCV 算法验证，ROC曲线得到 AUC=0.959。最终使用13种噬菌体的组合在SCD中显示出最精确、稳定的分类效果。

《一种用于早期肺癌筛查的新型自身抗体芯片》

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