岩青兰化学成分及抗氧化活性

　　摘 要：为有效利用岩青兰资源，测定了其不同极性萃取物中总酚和总黄酮的含量.结果表明，乙酸乙酯萃取物中总酚和总黄酮含量最高，分别达到74.5mg/g和426.70mg/g.采用 LC-MS技术，从样品中确定了圣草酚(eriodictyol)、komaroviquinone、胡麻素(pedalitin)、dracocequinoneA、gardeninB和蓟黄素(cirsi-maritin)6个化合物.体外抗氧化分析表明，岩青兰具有较强的抗氧化能力.

　　关键词：岩青兰;总酚;总黄酮;LC-MS分析;抗氧化

　　岩青兰(Dracocephalumrupestre Hance)又名毛建草，是唇形科(Lamiaceae)青兰属植物.该植物为多年生草本，株高15～42cm，叶片三角状卵形，边缘具圆锯齿;花期7-9月份，轮伞花序，花冠紫蓝色，全草具香气.在我国岩青兰主要分布在河北、山西、青海、内蒙古和辽宁等地，生于海拔650～2400m 草原、草坡或疏林下 [1].

　　据《中药大辞典》记载，岩青兰可全草代茶，主治外感风热、头痛寒热、咳嗽、黄疸性肝炎.除作为传统药材外，山西等地已将岩青兰开发成茶饮.已有研究发现，岩青兰同属植物提取物具有抗氧化[2-3]、抗肿瘤[4]、抗高原缺氧[5]、保护心血管系统[6-7]等药理作用.本研究对岩青兰的化学成分进行了分析，并对其抗氧化活性进行了测定，以便为其合理开发利用奠定基础.

　　1 材料与方法

　　1.1 实验材料

　　本实验所用的材料为岩青兰地上部分，采于北京东灵山海拔2000m 左右处.实验前将材料自然晾干，粉碎.

　　1.2 提取物的制备

　　将材料自然晾干后，用体积分数为95% 的乙醇进行提取，每次提取的时长为1周，重复4次.提取完成后合并提取液并进行抽滤，滤液通过旋转蒸发仪进行蒸发，得到总浸膏.留取部分总浸膏备用，其余部分用不同极性的溶剂进行萃取，所用溶剂分别为乙酸乙酯、石油醚和正丁醇，每种溶剂萃取5次.最后将得到的各层萃取物用旋转蒸发仪在40～50 ℃条件下旋转蒸发，自然晾干得到不同极性的萃取物.

　　1.3 样品中总酚、总黄酮含量的测定

　　总酚测定：将不同的样品配制成溶液，溶液的质量浓度为4mg/mL，取不同的样品溶液各0.125mL，分别加入Folin-ciocalteu试剂1mL，2min后，再分别加入质量分数为10%的碳酸钙溶液2mL，定容至10mL.在50 ℃、避光的条件下反应15min，采用紫外分光光度计在775.0nm 波长下测定其吸光度.总黄酮测定：将不同的样品配制成溶液，溶液的质量浓度为4mg/mL，取不同的样品溶液各0.5mL，分别加甲醇9.5mL，加质量分数为5%的亚硝酸钠溶液1mL，摇匀，放置6min，再分别加质量分数为10%的硝酸铝溶液1mL，摇匀，放置6min，分别加入质量分数为4%的氢氧化钠溶液10mL，定容至25mL，采用紫外分光光度计在503.3nm 波长下测定其吸光度.

　　1.4 LC-MS分析

　　采用柱子：ShimmadzuVPODScolumn(150mm×2.0mm，5μm).毛细管温度为260℃，紫外检测波长为280nm.分别用无水甲醇将乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物配制成适当质量浓度的溶液，进 样 量 为20μL.溶剂：A 为体积分数0.01%甲酸水溶液;B为乙腈.流速1mL/min.乙酸乙酯层程序：0～30min，B为10%～50%，30～35min，B为50%～100%，35～45min，B为100%.正丁醇层程序：0～30min，B为10%～30%，30～35min，B为30%～100%，35～45min，B为100%.

　　1.5 DPPH 自由基清除率的测定

　　参照李建飞等[8]方法，用 多 道 移 液 枪 在96孔 板 中 分 别 加 入 不 同 的 样 品 溶 液 100μL，再 加 入100μL60μmol/mL的 DPPH 标准溶液，加液后迅速避光，室温下反应40min，用酶标仪在517nm 下测定吸光度.重复3次.用 Vc溶液作为阳性对照.1.6 ABTS自由基清除率的测定用多道移液枪将不同样品溶液及对照品 Vc溶液各50μL加入96孔板，再加入150μLABTS，在30 ℃、避光条件下放置30min，通过酶标仪测定其吸光度，测定的波长为734nm.重复3次.

　　1.7 ·OH 自由基清除率的测定

　　用多道移 液 枪 将 不 同 样 品 溶 液 及 对 照 品 Vc 溶 液 各 75μL 加 入 96 孔 板，再 分 别 加 入 硫 酸 亚 铁(9mmol/L)、水杨酸-乙醇溶液(9mmol/L)和过氧化氢溶液(8.89mmol/L)各15μL，在避光、37 ℃恒温条件下反应30min后，通过酶标仪在510nm 下测定吸光度.重复3次.

　　1.8 总还原力的测定

　　总还 原 力 的 测 定 采 用 FRAP 法.在 酸 性 条 件 下，抗 氧 化 物 能 够 还 原 Ferric-tripyridyltriazine(Fe3+-TPTZ)产生 Fe2+ -TPTZ，这种物质呈蓝色.通过酶标仪在593nm 波长下测定其吸光度即可计算出样品中的总还原力.

　　用多道移液枪在96孔板中加入5μL不同质量浓度的硫酸亚铁标准溶液，通过酶标仪在593nm 下检测吸光度，绘制标准曲线.

　　用多道 移 液 枪 在 96 孔 板 中 分 别 加 入 FRAP 工 作 液 180μL，再 加 入 5μL 不 同 样 品，以 0.15～1.5mmol/L的 Trolox作为阳性对照，空白对照加入5μL蒸馏水，轻轻摇匀.37 ℃孵育5min后通过酶标仪在593nm 下检测吸光度.

　　2 结果与分析

　　2.1 总酚和总黄酮的含量

　　分别测出5个样品的吸光度值，并将其代入标准曲线的线性方程Y=109.06x+0.0603(0.002mg/mL≤ x≤0.012mg/mL)中，计算出不同样品中总酚质量浓度，在此基础上计算在不同提取物中的总酚含量，结果见表1.

　　分别测出5个样品的吸光度值，并将其代入标准曲线的线性方程Y= 0.4959x-0.0016(8μg/mL≤x≤ 48μg/mL)中，计算出不同样品中总黄酮的质量浓度，在此基础上计算不同提取物中的总黄酮含量(表1).

　　从表1可以看出，乙酸乙酯萃取物中总酚和总黄酮的含量最高，分别为74.5mg/g 和426.70mg/g，其次是总浸膏，水层萃取物中总酚和总黄酮的含量最低，其含量分别为1.7mg/g和31.05mg/g.

　　2.2 LC-MS检测结果

　　通过分析，在乙酸乙酯萃取物中检测到了化合物1和2，在正丁醇萃取物中检测到化合物3、4、5、6，如表2所示.

　　2.3 不同样品对 DPPH 自由基的清除率

　　通过酶标仪分别测定了不同样品对 DPPH 自由基的清除率，并与 Vc进行对比，结果如图1.从图1中可以看出，当样品质量浓度为100μg/mL时，乙酸乙酯萃取物的活性较好，对DPPH 自由基清除率达到69.7%;当质量浓度上升到200μg/mL时，总浸膏、正丁醇萃取物和乙酸乙酯萃取物对 DPPH 自由基清除率分别达到61.17%、65.02%和93.18%，对照品 Vc的 DPPH 自由基清除率为96.97%，乙酸乙酯萃取物的 DPPH 自由基清除率几乎与 Vc相当.在不同样品中，乙酸乙酯萃取物的 DPPH 自由基清除活性最高，其次是正丁醇萃取物、总浸膏，其IC50值分别为50.01、114.07和188.83μg/mL.水层和石油醚萃取物活性最低，其IC50值均在1000μg/mL以上.

　　2.4 不同样品对 ABTS自由基的清除率

　　不同样品对 ABTS自由基的清除率如图2所示.

　　从图2中 可 以 看 出，样 品 质 量 浓 度 达 到100μg/mL 时，总 浸 膏、乙 酸 乙 酯 萃 取 物 和 正 丁 醇 萃 取 物 对ABTS自由基清除率均达到50%以上，分别为54.92%、70.34%和61.24%.当质量浓度上升到200μg/mL时，以上3个样品对 ABTS自由基清除率分别上升为72.48%、89.61%和75.69%.不同样品对 ABTS自由基清除效果依次为乙酸乙酯萃取物>正丁醇萃取物>总浸膏>水层萃取物>石油醚萃取物，其IC50值分别为43.62、59.86、82.61、258.40和336.94μg/mL

　　2.5 不同样品对羟自由基的清除率

　　不同样品对羟自由基(·OH)的清除效果有明显的差异，其结果如图3所示.从图3 中 可 以 看 出，当 样 品 质 量 浓 度 为 50μg/mL 时，乙酸乙酯萃取物对羟自由基清除 率均达到50.05 %.当样品质量浓度为100μg/mL时，总浸膏、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物对羟自由基清除率分别为67.74 %、78.67%和59.81 %.当样品质量浓度在200μg/mL时，乙酸乙酯萃取物对羟自由基清除率高达94.32%，与对照 Vc(99.14%)相当.不同样品对羟基自由基清除效果依次为乙酸乙酯萃取物>总浸膏>正丁醇萃取物>石油醚萃取物>水层萃取物，其IC50值分别为44.27、59.79、66.95、103.31和330.99μg/mL.

　　2.6 不同样品的总还原力

　　通过测定不同质量浓度硫酸亚铁标准溶液的吸光度，绘制出标准曲线(图4)，得回归方程Y= 0.297x-0.0008(0.15mmol/L≤x≤1.5mmol/L，R2= 0.9998).

　　分别测出5个样品的吸光度值，将所测样品的吸光度值代入线性方程Y= 0.297x-0.0008中，计算出不同提取物中的抗氧化物质trolox[6-羟基-2，5，7，8-四甲基色烷-2-羧酸(6-hydroxy-2，5，7，8-tetramethyl-chroman-2-carboxylicacid)]的相对含量，见表3.

　　不同样品中总 Trolox相对含量差异显著，乙酸乙酯萃取物中总 Trolox相对含量最高，总浸膏和正丁醇萃取物次之，含量低的是石油醚和水层萃取物.

　　通过总酚含量与总还原力相关性分析，得出Y=0.6689x+3.1483(R2=0.9774)，详见图5.

　　图6为总黄酮含量与总还原力相关性，Y=0.1026x-0.0961(R2=0.8535).

　　通过以上分析可看出，总酚含量和总黄酮的含量与trolox相对含量有显著的正相关关系.trolox在6号碳的位置有1个酚羟基，正是该酚羟基的存在，赋予了trolox强大的抗氧化能力.trolox的相对含量代表了被测物质的总还原能力，根据以上结果可以得出，岩青兰中总酚极大地决定了该植物提取物的抗氧化能力，总黄酮的含量对抗氧化能力影响也非常大.

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　　3 讨论

　　本研究发现，岩青兰乙酸乙酯萃取物中总酚和总黄酮含量最高，分别达到74.5mg/g和426.70mg/g.此外，还从中检测到圣草酚等化合物.任冬梅[6]也曾从岩青兰中分离到圣草酚，这与本研究结果相一致.

　　自由基具有很强的氧化性，能将细胞中的蛋白质和 DNA 等物质氧化破坏，最终导致蛋白质失活，引发癌变、老化等[9].为了寻找天然抗氧化剂，人们对不同药用植物的抗氧化活性进行了研究，发现了一些抗氧化活性较强的植物，例如传统中药丹参[10]、甘草[11]、红景天[12]等.Wang 等 [13]研究了华北蓝盆花的抗氧化活性，发现其乙酸乙酯萃取物清除 DPPH 自由基的能力较好，IC50为8.47μg/mL.Dastmalchi等[14]研究发现，青兰属植物香青兰的提取物也有很好的抗氧化活性，对自由基有一定的清除作用.

　　任冬梅[6]通过 DPPH 法鉴定了香青兰和岩青兰的自由基清除能力，发现在 B环上的3'，4'邻二羟基取代的黄酮类化合物具有较好的抗氧化活性.已有研究表明，圣草酚能有效清除 DPPH 自由基，抑制自由基损伤生物大分子.

　　本研究表明，岩青兰乙酸乙酯萃取物具有较强的抗氧化活性，当 其 质 量 浓 度 为200μg/mL 时，对 DP-PH、ABTS和·OH 自由基清除率达到93.18%、89.61%和94.32%.正是由于岩青兰的乙酸乙酯萃取物中含有较多的总酚和总黄酮类物质，才使其具有较强的抗氧化作用.因此，岩青兰可作为一种天然的抗氧化植物资源被开发利用.

《岩青兰化学成分及抗氧化活性》

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