柑橘果酒中的类柠檬苦素及其脱除方法综述

　　摘要：类柠檬苦素是引起柑橘果酒后苦味的重要因素，综述了类柠檬苦素的结构、功能、苦味产生机理以及近年来国内外脱除柠檬苦素类化合物的有效方法，为柑橘果酒脱苦工艺的发展提供依据。。

　　关键词：柑橘果酒;柠檬苦素类化合物;脱苦;综述

　　柑橘(Citrus)是世界第一大水果，我国是柑橘的主要原产国。2017年，我国柑橘种植面积为262.3万hm2，产量达3931万t，均排世界第一，目前栽种的品种主要有金橘、温州蜜橘、椪柑、砂糖橘、脐橙等。柑橘的采收时期集中，经常会出现鲜果滞销、柑橘卖难等情况，从而造成一定的经济损失[1]。为了解决鲜果供过于求的问题，人们通常会将柑橘加工成食品，如柑橘罐头、柑橘酒等。

　　柑橘果酒(CitrusFruitWine)是以柑橘为原料经酵母发酵产生酒精和相关风味物质的一种饮料酒。柑橘果酒具有典型性香气，富含VA、VC和黄酮等活性成分，有利于人体的健康。目前柑橘果酒产业化加工较少，主要原因是柑橘加工后会产生苦味。这类苦味物质严重影响了柑橘果酒的口感，给消费者带来不愉快的体验[2]。柑橘中的苦味物质主要有2种，黄烷酮糖苷类化合物(Flavanoneglycosidecompounds，如柚皮苷、新橙皮苷、枸杞苷等)和柠檬苦素类化合物(Limonoids，如柠檬苦素、诺米林等)。柚皮苷苦味阈值较高，水溶液中阈值为20mg/L，主要存在于葡萄柚和苦橙中。柠檬苦素苦味阈值很低，水溶液中阈值为1.0mg/L，果汁中苦味阈值3.4mg/L，约为柚皮苷苦味阈值的20倍，因此柑橘果汁及果酒的“后苦”现象，主要是由柠檬苦素引起的[3-4]。该文主要概述近年来国内外有关柑橘果酒脱除类柠檬苦素苦味的最新研究进展，指出其存在的主要问题，并对其发展动态进行展望，以期为解决柑橘果酒加工苦味的瓶颈难题提供新思路，为我国果酒加工相关研究提供参考。

　　1柠檬苦素类化合物简介

　　1.1柠檬苦素类化合物的结构

　　柠檬苦素类化合物也称为类柠檬苦素，是芸香科(Rutaceae)和楝科(Meliaceae)植物的主要次生代谢产物，是一类高度氧化修饰的萜烯类化合物。1841年，科学家从柑橘中首次分离得到柠檬苦素[5]，到了20世纪60年代，科学家通过化学和X射线衍射的方法，确认了柠檬苦素的结构[6]，得到其分子式为C26H30O8，相对分子质量为470。类柠檬苦素是立体结构的配位化合物，其原型结构包含或源自一种具有4，4，8-三甲基-17-呋喃类固醇骨架的前体。所有天然存在的柑橘类柠檬苦素都含有一个呋喃环，在C-17处与D环相连接，C-3、C-4、C-7、C-16和C-17处均含有含氧官能团[7]。柠檬苦素类化合物主要存在于柑橘的果实、种子中，种子中含量最高[8]。柠檬苦素类似物种类丰富，主要包括柠檬苦素(Limomin)、诺米林(Nomilin)、脱乙酰诺米林(Deacetylnomilin)、诺米林酸(NomilinicAcid)等[9]。迄今为止已分离出大约300种柠檬苦素类化合物，而在柑橘属中已分离出38种柠檬苦素类似物和21种配糖体[10]。目前已经分离出的这38种柠檬苦素类似物中，表现出苦味的仅有6种，其中柠檬苦素的苦味最强[11]，其次是诺米林，类柠檬苦素的脱苦工艺就是将这些物质的含量降低。

　　1.2柠檬苦素类化合物的功能

　　柠檬苦素类化合物具有抗肿瘤、抗炎等生理活性[12]。Miller等[13]发现某些柑橘类柠檬苦素可抑制7，12-二甲基苯[a]炭疽杆菌诱导的口腔肿瘤发生。Wang等[14]通过试验首次发现类柠檬苦素具有较高的抗氧化生物活性。Tian等[15]研究发现在体外培养的人乳腺癌细胞中，柠檬苦素类化合物可抑制雌激素受体阴性和阳性细胞的生长，具有抗癌细胞增殖作用。柠檬苦素类化合物在水果中以糖苷和苷元的形式存在，Poulos等[16]评价了其对2种人类癌细胞系(SH-SY5Y神经母细胞瘤和Caco-2结肠腺癌)以及一种非癌哺乳动物上皮中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的毒性作用，通过3-[4，5-二甲基噻唑-2-酰基]-2，5-二苯基四氮唑还原和光学显微镜观察，发现癌细胞暴露于苷元(即柠檬苦素、诺米林)后，活性显著降低。SH-SY5Y细胞较Caco-2细胞对柠檬苦素更敏感，而非癌性CHO细胞在细胞数量和细胞形态上几乎没有变化，说明类柠檬苦素对肿瘤细胞具有较强的多方面杀伤作用，但对CHO细胞的杀伤效果相对较差。柠檬苦素除了具有上述功能外，还具有抗氧化、预防心脑血管以及利尿等功效。

　　1.3柠檬苦素类化合物的苦味产生机理

　　柑橘成熟后柠檬苦素含量非常少，新鲜的果实或者鲜榨的柑橘汁都没有苦味，放置一段时间或者经过加工处理之后就会产生苦味。研究证明，果实正常成熟过程中，柠檬苦素前体物质柠檬苦素A-环内酯(LimonoidA-ringLactone，LARL)逐渐被柠檬苦素UDP-葡萄糖苷转移酶(Limonoid-UDP-glycosylTransferases，LGT)糖基化为配糖体(LG)[17]，此时是不具有苦味的。而当果实受到一定的机械损伤等外界环境胁迫时，LARL在柠檬苦素D环内酯水解酶的催化下迅速转化为具有强烈苦味的柠碱[3，18-19]。

　　2柑橘果酒中柠檬苦素类化合物的掩盖或脱除方法

　　尽管柠檬苦素类化合物具有很多的生理功能，有利于人体的身体健康，但是其严重影响柑橘果酒的风味，从而制约柑橘果酒产业的发展。最大程度掩盖或者脱除柑橘果酒中的苦味物质是发展该产业的关键。

　　2.1添加苦味抑制剂掩盖苦味

　　苦味抑制剂主要是通过阻塞苦味受体、截断苦味信号传递等方式来降低或消除苦味[20]。添加苦味抑制剂可以掩盖柑橘果酒中的柠檬苦素类化合物产生的后苦味，起到有效麻痹味觉细胞，提高苦味感受阈值的作用[21]。蔗糖是常用的苦味抑制剂，但效果不明显，而添加量过高会损害人体健康。β-环糊精由7个葡萄糖残基以α-1，4-糖苷键连接而成，具有亲水的外围和疏水的内腔，在溶液中可与多种有机物形成包合物，研究表明其可用于掩盖柑橘中的苦味[22]。0.05%~0.50%的β-环糊精对柑橘果酒脱苦效果较好。另外，新地奥明也是比较理想的苦味抑制剂。该物质是新橙皮苷脱氢获得的一类黄酮物质，能够起到掩盖苦味、调和风味的作用。将新地奥明加入到果酒中，它能与柠檬苦素或诺米林竞争而结合到苦味受体分子上，最终使苦味阈值增大[23]。研究发现，柑橘果酒中添加60mg/kg的新地奥明，可以使苦味阈值从3.4mg/kg升高至6.8mg/kg[24]。

　　目前，市场上出现了许多新型甜味剂。新橙皮苷二氢查尔酮(NeohesperidinDihydrochalcone，NHDC)是一种黄酮类衍生物，从天然柑橘等植物中提取出来经过氢化而成[25]。这种甜味剂甜度是蔗糖的1500~1800倍，而且口感清爽、余味持久，改善口味及屏蔽苦味的功效极佳，常用来改善食品与饮料味道[26]。但是，目前单一的苦味抑制剂无法全面抑制柠檬苦素类化合物的苦味。

　　2.2优化工艺降低苦味

　　柑橘果酒的风味受很多工艺的影响，例如鲜果的成熟度和榨汁方式等。因此实验室通常挑选比较成熟的柑橘，通过慢速打浆或者钝刀打浆的方式让成品更加清甜可口[27]。果肉的含量也需要严格控制，可以采用离心分离的方法去除果肉颗粒[28]。目前，低醇发酵、低温贮藏是未来的发展趋势，不仅满足消费者对低酒精度饮料酒的需求，同时低醇发酵、低温贮藏生产的柑橘果酒含有较少的柠檬苦素，成品酒的口感较好。研究表明，柚子果汁经浓缩和4℃贮藏4d，离心后柠檬苦素含量分别下降17%和31%[29]。

　　2.3吸附法脱苦

　　吸附法是商业上常用的脱苦方法，其操作简单、成本低、处理时间短，处理温度低、吸附过程中不产生其他的杂质。活性炭、硅胶、离子交换树脂等是生产中常用的吸附剂。但是吸附剂容易饱和、阻塞、再生时间较长，吸附后营养成分会有一定的损失。

　　Zhang等[30]首次以表面分子印迹聚合物(SMIPs)为吸附剂从柠檬汁中去除柠檬苦素。结果表明，与表面分子非印迹聚合物(SNiPs，8.12mg/g)相比，SMIPs(27.72mg/g)具有更高的吸附容量，并且该吸附剂对柠檬苦素具有更好的选择识别作用，最终从柠檬汁中吸附了几乎所有的柠檬苦素。张晓丹等[31]

　　通过单因素试验和正交优化试验，得出在4%树脂、温度25℃、时间25min、转速100r/min的工艺条件下，椪柑酒中柠檬苦素和诺米林的含量分别降低了49.54%和33.69%，VC的损失率仅为25.12%，说明X16树脂对苦味物质的脱除有显著效果，并且对营养成分的损失较小。Bao等[32]采用大孔吸附树脂EXA-45和LX-900对果汁进行吸附脱苦，发现EXA-45比LX-900具有更高的吸附容量和更快的吸附速率，表明EXA-45比LX-900的应用前景更好。因此在实际应用中，选择高效的吸附材料有利于提高吸附性能和吸附效率。

　　2.4酶法脱苦

　　酶法脱苦主要是通过相应的酶作用于柠檬苦素，使之生成不含苦味的物质。酶法脱苦专一性强、效率高，并且对果酒中的营养成分损失少[33]。柠檬苦素脱苦酶主要有柠酸A-环内脂脱氢酶(LimonateA-cyclicLipidDehydrogenase)、柠檬苦素环氧酶(LimoninEpoxidase)、乙酰基裂解酶(Acetyl-lyase)、柠檬苦素醇脱氢酶(Limoninalcoholdehydrogenase)和反式消除酶(Transeliminase)等。将柠酸A-环内脂或柠檬苦素转化为其他物质就可减轻苦味。柠酸A-环内脂脱氢酶可将柠酸A-环内脂转化为无苦味的17-脱氢柠酸A-环内脂，柠檬苦素环氧酶可将柠檬苦素转化为没有苦味的脱氧柠檬苦素，柠檬苦素醇脱氢酶可以将柠檬苦素转化为柠檬苦素醇，而反式消除酶则可将柠檬苦素转化为没有苦味的反-19-羟基黄柏酮酸[34]。这些酶对诺米林的作用方式与对柠檬苦素的作用方式相似，其中乙酰基裂解酶代替了反式消除酶作用于诺米林，将其转化成黄柏酮。

　　果酒中含有大量的有机酸，pH值偏酸性，而柠檬苦素类化合物脱苦酶的最适pH值通常偏碱性，脱苦之前需要先调节柑橘果酒的pH值，而这将影响柑橘果酒的风味[35-36]。同时，利用酶法脱苦还需面临酶的提取纯化问题。若将产生这些酶的细菌细胞先固定化，再用于柑橘果酒的脱苦，可以减少酶的提纯工作。目前，常用的细菌有球形节杆菌、假单胞菌和束红球菌等[36]。高秋芬等[37]研究黑曲霉胞外酶对琯溪蜜柚果汁的脱苦作用，结果表明，经固态发酵12d，柠檬苦素的去除率达到27.7%;液态发酵10d，柠檬苦素的去除率达到30.8%。这说明黑曲霉胞外酶液可显著降低柠檬苦素的含量，达到有效脱苦的目的，同时也可初步确定黑曲霉胞外酶液中含有柠檬苦素类脱苦酶，可用于柑橘成品脱苦。Hasegawa等[38]利用果糖、半乳糖和柠檬酸等廉价碳源制备了能代谢柠檬苦素的棒状杆菌细胞，然后将棒状杆菌细胞在丙烯酰胺凝胶中固定化，再用于开发生物脱苦技术。该工艺显著降低了柑橘汁中的柠檬苦素和诺米林的含量，尤其是降低诺米林含量的效果理想，而且脱苦处理对柠檬酸、苹果酸、抗坏血酸、果糖、葡萄糖、蔗糖等其他柑橘成分无不良影响，可以用于柑橘果酒的脱苦。

　　酶法脱苦具有许多的优点，但是成品酶或菌种的筛选及培养主要还停留在实验室阶段。

　　2.5膜分离技术脱苦

　　膜分离技术也是目前研究较多的一种脱苦方式，其分离效率高、操作温度低、处理量大，可用于连续化生产[34，39]。按照分离原理不同，可将合成膜分为滤膜和溶解-扩散膜。滤膜分离主要是根据分子量的大小来决定其是否可以通过膜孔径，只有小于膜孔径的分子或物质才可以顺利通过膜。而溶解-扩散膜则主要是根据溶质分子在膜中的溶解性和扩散性进行分离。柑橘中柠檬苦素是非极性分子，呈电中性，可以溶解在液膜中，然后再通过扩散作用进入到溶液。研究显示，在25℃时，溶解-扩散膜能将溶液中的柠檬苦素由55mg/L降到11mg/L，或从40mg/L降至8mg/L，营养成分的损失不超过5%[40]。与滤膜相比，溶解-扩散膜能将浓度极化现象降至最低，且具有很强的抗污染能力[34，41]。

　　2.6超临界CO2脱苦

　　超临界CO2技术脱除果酒中类柠檬苦素具有操作条件简单、分离容易、提取速度快、活性成分和热敏性成分不易被破坏等优点。孟鹏等[42]优化了金柑中柠檬苦素的超临界CO2提取工艺参数，在萃取压力33MPa、萃取温度50℃、萃取时间2.2h的条件下，柠檬苦素的去除量达7.02g/kg。Patil等[43]从葡萄柚中提取柠檬苦素类化合物，确定了压力、温度、萃取时间、CO2流量及CO2给样方式等最佳萃取条件，结果表明在483MPa、50℃、60min条件下，从柱顶向外注入CO2流量约为5.0L/min，柠檬苦素提取产量最高为6.3mg/g。但该方法需要超临界高压装置、生产成本较高，不适合在工业上大规模生产使用。

　　2.7代谢法脱苦

　　研究人员发现晚期采收的柑橘榨出的果汁较早期采收的甜，受这一现象的启发，学者们研究了加快柑橘中苦味物质代谢的方法[34，36]。徐仲伟等[44]选择浓度为2000mg/L的乙烯利进行脱苦试验，结果表明，用乙烯利处理果实5d，柠碱苦味可以降低44.9%。需要注意的是，乙烯利的浓度不能过高，否则柠碱会重新析出，且浓度控制不当也会导致烂果。植物激素也影响柑橘中类柠檬苦素的含量。研究表明，吲哚乙酸、吲哚丁酸、萘乙酸、2，4，5-三氯氧乙酸、脱落酸等生长素是诺米林合成的有效抑制剂。但是脱落酸的抑制作用能够被细胞分裂素解除[45]，因此在果实成熟过程中可以喷洒植物激素降低果实诺米林的含量。

　　2.8基因工程脱苦

　　利用基因工程技术改良柑橘的延迟苦味性状是一个新的突破口。通过转基因手段引入酶基因，能够将柑橘中具有苦味的物质代谢为其他非苦味的物质。

　　Kita等[46]从柑橘反照率中分离到一个能编码柠檬酸二磷酸葡萄糖转移酶(limonoidGTase，LGT)的cDNA克隆，研究了其对果实中柠檬酸苷积累的贡献。结果表明，表达载体的体外转化产物具有LGT活性。CitlGT作为单一拷贝基因存在于柑橘基因组中。在脐橙果实发育过程中，CitlGTmRNA对应的转录物数量的变化与柠檬酸苷含量的变化规律相同。这表明，CitlGT的转录调控了柑橘果实中柠檬酸苷元向葡萄糖苷的转化。

　　在柑橘生长和成熟的过程中，LARL能够在LGT基因的催化下转变成了无苦味的柠檬苦素类似物[47]。在未来的脱苦技术中，有望将LARL的基因导入柑橘基因中，降解柑橘中的柠檬苦素。。

　　3小结与展望

　　柑橘果酒口感醇厚，风味独特，又具有浓郁的酒香和果香，深受消费者青睐，但是类柠檬苦素对产品的影响制约了柑橘果酒产业的发展。脱除柑橘酒中类柠檬苦素的方法有很多，具有较好应用前景的方法也较多。例如添加苦味抑制剂可以较快速的掩盖苦味;吸附法简单易行，处理温度低、时间短;酶法高效、快速，选择性高;膜分离技术分离效率高、操作温度低、处理量大，易于连续化生产，且由于材料化学的不断发展，性能优良的膜材料也相继问世，膜分离技术必将在柑橘脱苦中具有更大的发展前景。基因工程等操作复杂，暂时无法应用于工业化脱苦。

　　目前，在食品加工过程中优化工艺降低苦味仍是当下的研究热点。随着人们对健康要求的不断提高，低醇发酵、低温贮藏将成为未来柑橘果酒的发展趋势，低醇发酵、低温贮藏加工的果酒，不仅酒精度低，而且能更大程度地保存原果的风味。因此优化果酒发酵的工艺，开发营养、风味及功能俱佳的柑橘低醇果酒是目前研究的重点和难点。

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