中华鳖Foxl2基因克隆及外源性激素对其表达的影响

　　摘要: 外源性激素在中华鳖(Pelodiscus sinensis)性别决定有重要作用, 为给中华鳖性别决定机制研究提供生物学信息, 首次克隆和分析了中华鳖Foxl2 cDNA部分序列。为研究其在遗传和生理水平的差异, 以10 mg/kg剂量17α-甲基睾酮(MT)和17β-雌二醇(E2 )分别对中华鳖雌雄个体注射, 检测0、6h、12h、24h、48h、7d和14d性腺Foxl2 mRNA表达水平。获得中华鳖Foxl2基因(GenBank登录号: KP734210)部分 cDNA长903 bp, 共编码 300个氨基酸, 属于叉头框转录因子家族, 参与卵巢发育和功能维持; 多重序列比对显示, Foxl2具有典型的 FH结构域, 与红耳龟的同源性最高, 达到99%; 系统进化树分析显示, 中华鳖Foxl2基因与爬行动物Foxl2基因聚为一个亚支, 且与西部锦龟Foxl2基因距离最近。荧光定量PCR结果显示, 与对照组相比, 注射E2后24h, 卵巢Foxl2 mRNA表达水平被极显著上调(P<0.001), 7d和14d后, 精巢Foxl2 mRNA表达水平极显著上升 (P<0.001); 注射MT后24h, 精巢和卵巢Foxl2 mRNA的表达水平均极显著升高(P<0.001)。结果表明, E2和MT促进Foxl2表达, E2促进其表达的性别差异比MT明显。研究可为了解Foxl2的功能及明确外源性激素调控中华鳖 Foxl2的分子机制提供基础资料。

　　关键词: 中华鳖; Foxl2基因; 雌二醇; 甲基睾酮; mRNA表达

　　Foxl2(Forkhead transcriptionfactor gene 2)是叉头状转录因子超家族(Forkhead transcriptionfactor, FOX)成员之一[1, 2] , 1993年被发现, 主要在垂体和卵巢颗粒细胞中表达, 通过转录调节其目的靶基因的转录、蛋白表达, 参与颗粒细胞的增殖与分化, 与卵巢发育性二态分化和卵巢功能维持密切相关[2—4]。 Foxl2突变引起小睑裂综合征(BPES)、卵巢早衰 (POF)、肿瘤及山羊的无角间性综合征(PIS)[4—6]。迄今Foxl2基因已在许多脊椎动物和部分无脊椎动物中获得, 且结构高度保守。Foxl2在哺乳动物中研究最为深入, 被认为是雌性相关基因[4, 6]。国外学者对许多龟鳖动物的Foxl2基因进行了较为详细的研究[7, 8] , 但对于中华鳖Foxl2基因的相关研究未见文献报道。

　　中华鳖(Pelodiscus sinensis)隶属于爬行纲、龟鳖目、鳖科(Trionychidae)、鳖属(Pelodiscus), 之前温度依赖型性别决定模式已被公认, 但总有 20%—30%的个体并没有沿温度方向发育, 遗传因素是影响其性别发育方向的重要方面[9]。对于爬行动物, 关键基因除外, 性激素在一定程度调控性别分化[10, 11] , 且在不同的发育阶段发挥不同的作用 [12]。

　　本实验室克隆了Foxl2 cDNA部分序列, 并以 10 mg/kg剂量的MT和E2对中华鳖成鳖进行注射实验, 通过分析Foxl2表达变化, 旨在生理水平显示外源性激素处理后Foxl2的响应模式, 以分析激素与性别相关基因的关系, 为中华鳖性别调控机制提供一定的生物学资料。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　2015年5月22日, 从重庆市北碚区歇马镇星云养殖场购买150只中华鳖, 体长为(12.01±2.01) cm, 体宽为(11.20±1.20) cm, 体重为(291.80±103.80) g, 置于室内淡水循环养殖池中暂养3d, 水源为曝气自来水, 水温为(26±0.5)℃。共分为5个组。

　　1.2 试剂

　　17α-甲基睾酮(MT)和17β-雌二醇(E2 )购自生工生物工程(上海)股份有限公司, Trizol试剂以及 pMD18-T Vector购自Takara, IScriptTM cDNA Synthesis Kit以及SsoFast Eva Green购自Bio-Rad, GoTaq(R)Green MasterMix和BM5000 DNA Marker购自Promega, 其余国产分析纯试剂, 购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

　　1.3 实验设计

　　在本实验开展的前期, 已经研究了中华鳖Foxl2 多种组织的时空表达, 结果表现出典型的性别二态性, 卵巢表达量明显高于精巢表达量(结果待发表), 在此研究工作的基础上, 以同一浓度激素分别注射雌性与雄性个体, 充分显示E2和MT对中华鳖成鳖 Foxl2基因表达的影响。

　　在驯养3d后, 剔除体弱或受伤个体, 测量体型参数, 注射激素后放入对应编号养殖池。1号池为对照组, 2、3、4、5号池为实验组。剂量为10 mg/kg, 每组设3个重复, 每个重复10只, 实验周期15d。注射后的0、6h、12h、24h、48h、7d和14d时间点随机抽取实验个体, 以0为对照组, 并取出卵巢和精巢组织置于液氮中保存备用, 后转入–80℃冰箱保存, 以备总RNA提取。

　　1.4 总RNA提取与cDNA合成

　　上述采集到的组织样品用研钵在液氮中充分研磨, 取100 mg左右的研磨干粉, 根据Trizol(TakaRa) 一步法提取各组织样品总RNA, 所得到的总RNA定量到1 μg。通过1.5%的琼脂糖凝胶电泳, Goldview染色, 检测RNA的完整性。将所有样品的总 RNA用微量核酸测定仪(NanoDrop 1000)测定其浓度和纯度, 确保OD值在1.8—2.0。根据IScriptTM cDNA Synthesis Kit(Bio-Rad)试剂盒合成cDNA, 得到的cDNA –20℃保存备用。

　　1.5 基因克隆和序列分析

　　根据Ensembl网站预测的中华鳖Foxl2基因 mRNA序列, 针对于Foxl2基因的保守区域, 利用 Primer Premier 5.0软件来设计兼并引物, 用于后续实验过程中的同源克隆。设计好的引物序列由华大基因公司合成; 所涉及的引物如下: Foxl2 (F: 5′- ATGATGGCCAGCTACCAGG-3′, R: 5′-CTAGATG TCTATCCGGGAGTGC-3′); GAPDH (F: 5′-AGAA CATCATTCCAGCATCCA-3′, R: 5′-CTTCATCA CCTTCTTAATGTCGTC-3′, GenBank登录号:AB 124567.1)。引物均稀释为10 μmol/L备用。

　　2 结果

　　2.1 中华鳖Foxl2基因部分cDNA克隆

　　以卵巢组织cDNA为模板进行PCR, 产物电泳显示一条约为903 bp的片段, 随后经华大基因公司测序, 经NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)进行序列比对, 确定为中华鳖Foxl2基因片段, 编码大约300个氨基酸残基。将该序列提交GenBank, 已获得登录号: KP734210

　　2.2 E2对雌雄中华鳖Foxl2基因表达的影响

　　如图 2所示, 处理6h后雌性个体中Foxl2的表达量高于对照组, 差异不显著(P>0.05), 12h和24h后, E2极显著上调雌性个体Foxl2的表达量(P<0.001), 其表达量呈现与时间相关的增加趋势, 分别增加到对照组的8倍和18倍, 尤其在24h出现表达高峰, 至第48h和第7天时雌性个体Foxl2的表达量下降, 差异不显著(P>0.05); 至14d后E2又显著提升Foxl2的表达量(P<0.05), 达到对照组的5倍; 处理6h、24h和 48h后雄性个体Foxl2的表达量低于对照组, 差异不显著(P>0.05), 至7d之前, E2对雄性个体Foxl2的表达影响均不显著(P>0.05), 至7d和14d后, E2极显著上调Foxl2的表达量(P<0.001), 均增加到对照组的 5倍。结果显示: 1 mg/mL E2明显促进雌性中华鳖 Foxl2的表达, 促进高峰在24h, 随着时间的推移其促进作用呈现减弱的趋势; 1 mg/mL E2在注射后期促进雄性中华鳖Foxl2的表达, 其促进高峰时间比雌性个体大大延迟, 表达高峰出现在7d和14d, 且其表达量整体要低于在雌性个体中的表达量。 2.3 MT对雌雄中华鳖Foxl2基因表达的影响如图 3所示, 处理6 h和12h后雌性个体中 Foxl2的表达量高于对照组, 差异不显著(P>0.05); 至24h之前, MT对雌性个体Foxl2的表达影响不显著(P>0.05), 随着时间的延长; 至24h后, MT极显著上调雌性个体中Foxl2的表达(P<0.001), 出现表达高峰, 达到对照组的17倍; 至第48h、第7和第14天后, Foxl2的表达量呈现显著下降的趋势(P<0.05), 但均稳定在高于注射前5倍的水平。处理6h和 12h后雄性个体Foxl2的表达量与对照组持平, 差异不显著(P>0.05); 随着注射时间的延长, 尤其在24h, MT极显著促进Foxl2的表达(P<0.001), 出现表达高峰, 达到对照组的5倍; 第48h后, 其表达量低于对照组(P>0.05); 7d后, Foxl2的表达量又出现显著回升的趋势(P<0.05); 至14d后, 其表达量略微下降。

　　结果显示: 1 mg/mL MT明显促进雌性中华鳖 Foxl2的表达; 除48h外, 1 mg/mL MT对雄性中华鳖 Foxl2的表达呈现不同程度的促进作用, 但其作用没有雌性明显, 且无论雌雄, 24h时MT的促进作用最强。

　　3 讨论

　　3.1 中华鳖Foxl2基因序列分析

　　多重序列比对显示中华鳖Foxl2基因部分片段含有一个高度保守的FH结构域, 且与其他很多物种具有很高的相似性, 说明该结构域在不同物种生长发育过程中发挥重要作用; 同源性分析表明, 中华鳖Foxl2基因是已发现物种Foxl2基因的同源基因, 该基因在进化上具有较高的序列保守性和功能一致性; 其中与红耳龟和西部锦龟的同源性分别达到99%和92%, 说明其在进化上与爬行类的同源性; 聚类分析表明中华鳖与西部锦龟的Foxl2基因在同一大支, 而与氨基酸同源性较高的红耳龟的 Foxl2基因亲缘关系较远, 这说明Foxl2基因在进化过程中承受了不同的选择压力, 最终导致不同物种之间该基因的进化速率差异, 但是其在进化过程中变异还是较小, 且保守性很高, 其演化关系也与生物学结果一致。

　　3.2 E2对中华鳖Foxl2基因表达的影响

　　在非哺乳脊椎动物中, 雌激素是卵巢分化的关键因素, 但其作用机制仍不甚了解。本研究结果显示, E2促进中华鳖Foxl2基因的表达, 雌性的促进作用比雄性明显, 且其表达高峰时间比雄性提前(提前一周), 可以判断E2以不同的途径调控中华鳖雌雄个体中Foxl2基因表达。目前国内外对中华鳖 Foxl2基因的研究尚少见报道。多数文献报道雌激素促进Foxl2的表达[13, 14] ; 降低雌激素合成或者抑制雌激素信号转导均可显著抑制Foxl2的表达[15, 16] , 如南方鲇(Southern catfish)[17]、虹鳟(Rainbowtrout)[18]、鸡(Gallus gallus) [19]以及稀有鲫(Gobiocypris rarus) [20] ; 关于其调控机制, 有学者解释为 Foxl2基因通过激活芳香化酶(雄激素转化为雌激素的关键酶)的表达, 从而共同调控雌激素的生成[21, 22] ; 哺乳动物中也有类似现象[23] ; 本研究中雌性的表达结果与以上研究结果一致。雌激素信号传导过程依赖于细胞环境和受体的存在, 即雌激素受体 (ERα和ERβ)以及跨膜受体GPER(非基因组通路), 基因组通路(ERα和ER)的表达水平可以发生转换, 这种转换允许E2在不同的方向介导其作用并调节未成熟支持细胞的增殖[24]。正常雌性个体中雌激素受体及其相应原件均处于非激活状态。从本研究结果来看E2可能通过激活雌性个体中的ERα或者ERβ来启动相应原件(在基因转录水平上)上调 Foxl2的表达, 当细胞内激素浓度发生改变, 则开始调动GPER来调节激素平衡。但是我们并没有检测内源激素水平和性腺发育状态, 所以不能进行验证, 而且雌激素的具体作用机制比较复杂, 这也是我们后续的研究热点。最

　　新研究报道, 雌激素在动物雄性个体中同样发挥重要作用, 其中雌激素介导的ERα信号对于生殖细胞活性和维持生精上皮的正常组织至关重要。雌激素的生理水平对精子生成至关重要, 高剂量对精子发生有损伤作用, 而低剂量则对其有积极作用[24]。Hultman等 [25]也发现EE2处理雄性虹鳟后, Foxl2表达水平上升。中华鳖雄性个体中Foxl2的表达水平在E2暴露7d后明显上升, 这说明E2在雄性中华鳖生长后期发挥了重要作用, 但是对于具体机制, 尚不清晰, 还需进一步研究。

　　3.3 MT对中华鳖Foxl2基因表达的影响

　　中华鳖雌雄个体注射MT后, Foxl2基因表达增强, 在24h时均出现表达高峰, 之后逐渐减弱, 其变化趋势可能与体内外源MT有效剂量的变化相关, 表明中华鳖雌雄个体以相同的节奏和强度应答外源MT, 24h是Foxl2基因应激MT的敏感时期, 且 MT对雌性个体的作用比雄性强烈。

　　有文献报道MT在鱼类等性逆转过程中发挥重要作用[26, 27] ; Fenseke和Segner[28]用10000 ng/L剂量的MT处理斑马鱼, 结果发现CYP19b表达量上升。雄激素的信号传导过程主要依赖以下3个途径: 直接与雄激素受体(AR)结合、或者在芳香化酶的作用下转化为雌二醇, 随后雌二醇与雌激素受体结合而发挥效应, 也可以转化为二氢睾酮(DHT)。本研究结果表明Foxl2基因的表达依赖以上机制的相互作用。MT影响雌雄个体的高峰期一致, 也说明 MT促进中华鳖Foxl2基因表达的性别差异较小, 但是以上机制之间的具体作用机理及如何切换我们目前还不清楚。而且MT是直接作用于Foxl2基因还是通过间接的激素平衡反馈机制, 我们也不得而知。我们推测MT暴露不久后, MT转化为了内源性的E2 , 雌雄性个体的应答机制间接转为拟雌激素效应, 并通过干扰内源性激素的合成及代谢而发挥作用。此外还有研究表明MT抑制Foxl2基因的表达 [29] , 这可能由于多种因素导致, 例如所使用的性激素化合物种类不用; 所采用方法的不同; 注射时间和浓度的差异; 或者是实验动物所处的不用发育或生理时期等因素造成的。相关研究表明, 使用外源雄激素和芳香化酶抑制剂后, 血清中E2水平下调 [30—32] , 但是我们没有检测中华鳖血清内激素含量的变化, 所以无法进行验证, 这也是本文的不足之处。总之, 基因在信号通道和代谢2个水平产生重 .

　　参考文献:

　　[1] Uhlenhaut N H, Treier M. Forkhead transcription factors in ovarian function [J]. Reproduction, 2011, 142(4): 489—495

　　[2]Ellsworth B S, Egashira N, Haller J L. Foxl2 in the pituitary: molecular, genetic, and developmental analysis [J]. Molecular Endocrinology, 2006, 20(11): 2796—2805

　　[3] Goulvent T, Ray-Coquard I, Borel S, et al. DICER1 and Foxl2 mutations in ovarian sex cord-stromal tumours: a GINECO group study [J]. Histopathology, 2016, 68(2): 279—285

　　[4] Boulanger L, Pannetier M, Gall L, et al. Foxl2 is a female sex-determining gene in the goat [J]. Current Biology, 2014, 24(4): 404—408

　　[5] Shi F, Ding S, Zhao S, et al. A piggyBac insertion disrupts Foxl2 expression that mimics BPES syndrome in mice [J]. Human Molecular Genetics, 2014, 23(14): 3792—3800

　　[6] Corrêa F J, Tavares A B, Pereira R W, et al. A new Foxl2 gene mutation in a woman with premature ovarian failure and sporadic blepharophimosis-ptosis-epicanthus inversus syndrome [J]. Fertility and Sterility, 2010, 93(3): 1006. e3—e6

　　[7] Sarre S D, Ezaz T, Georges A. Transitions between Sexdetermining systems in reptiles and amphibians [J]. Annual Review of Genomics and Human Genetics, 2011, 12(1): 391—406

　　[8] Woolgar L, Trocini S, Mitchell N, et al. Key parameters describing temperature-dependent sex determination in the southern most population of loggerhead sea turtles [J]. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology, 2013, 449: 77—84

　　[9] Bachtrog D, Mank J E, Peichel C L, et al. Sex determination: why so many ways of doing it [J]? PLoS Biology, 2014, 12(7): 1001899

　　[10] Kumar S, Mukherjee T K, Guptasarma P. Arsenic and 17- beta-estradiol bind to each other and neutralize each other’s signaling effects [J]. Biochemical and Biophysi-

　　[11] cal Research Communications, 2016, 477(4): 575—580 LeGros T, McConnell D, Murry T, et al. The effects of 17 alpha-methyltestosterone on myocardial function in vitro [J]. Medicine and Science in Sports and Exercise, 2000, 32(5): 897—903

　　[12] Dean R, Mank J E. The role of sex chromosomes in sexual dimorphism: discordance between molecular and phenotypicdata [J]. Journal of Evolutionary Biology, 2014, (27): 1443—1453

　　[13] Jiang W B, Yang Y H, Zhao D M, et al. Effects of sexual steroids on the expression of Foxl2 in Gobiocypris rarus [J]. Comparative Biochemistry and Physiology B, 2011, 160(4): 187—193

　　[14] Gui Y Y, Nan C, Xue M Q, et al. 17-beta-estradiol upregulates apolipoprotein genes expression during osteoblast differentiation in vitro [J]. Bioscience Trends, 2016, 10(2): 140—151

　　[15] Wu G C, Tey W G, Li H W, et al. Sexual Fate Reprogramming in the Steroid-Induced Bi-Directional Sex Change in the Protogynous Orange-Spotted Grouper, Epinephelus coioides [J]. PLoS One, 2015, 10(12): e0145438

　　[16] Wang H, Wu T, Qin F, et al. Molecular cloning of Foxl2 gene and the effects of endocrine-disrupting chemicals on its mRNA level in rare minnow, Gobiocypris rarus [J]. Fish Physiology and Biochemistry, 2012, 38(3): 653—664

　　[17] Vizziano-Cantonnet D, Baron D, Mahè S, et al. Estrogen treatment up-regulates female genes but does not suppress all early testicular markers during rainbow trout male-to-female gonadal transdifferentiation [J]. Journal of Molecular Endocrinology, 2008, 41(5): 277—288

　　[18] Baron D, Cocquet J L, Xia X H, et al. An evolutionary and functional analysis of Foxl2 in rainbow trout gonad differentiation [J]. Journal of Molecular Endocrinology, 2004, 33(3): 705—715

　　[19] Hudson Q J, Smith C A, Sinclair A H. Aromatase inhibition reduces expression of FOXL2 in the embryonic chicken ovary [J]. Developmental Dynamics, 2005, 233(3): 1052—1055

　　[20] Gao J, Zhang Y, Yang Y, et al. Effects of 17 alphamethyltestosterone on transcriptome, gonadal histology and sex steroid hormones in rare minnow (Gobiocypris rarus) [J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part D Genomics Proteomics, 2015, 15: 20—27

　　[21] Liu Z, Wu F, Jiao B, et al. Molecular cloning of double sex and mab-3-related transcriptionfactor 1, forkhead transcription factor gene 2, and two types of cytochrome P450 aromatase in Southern catfish and their possible roles in sex differentiation [J]. Journal of Endocrinology, 2007, 194(1): 223—241

　　[22] Kazeto Y, Trant J M. Molecular biology of channel catfish brain cytochrome P450 aromatase (CYP19A2): cloning, preovulatory induction of gene expression, hormonal gene regulation and analysis of promoter region [J]. Journal of Molecular Endocrinology, 2005, 35(3): 571—583

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