质谱技术表征糖药物结构的前沿进展

　　摘要：目前，小分子药物研究已经进入平台期，而大分子生物药物迅速发展起来。糖药物作为生物药中尤为重要的一类，被广泛应用于肿瘤、心脑血管疾病等的预防和治疗。然而无论骨架糖链还是修饰性糖链，都具有结构复杂且微不均一性的特点，这对现代分析技术提出了较高的要求。随着软电离技术、多级质谱技术的发展以及分辨率和灵敏度的提高，质谱技术已被广泛应用于糖类药物的分析和表征。对糖药物、质谱技术进行了简要的介绍，并以多糖药物和糖缀合物类药物为例阐述了质谱在糖药物结构表征方面的技术进展，此外还就质谱在糖药物新药及仿制药物研发和注册方面的应用进行了讨论。

　　关键词：质谱;糖药物;结构表征

　　21世纪以来，随着经济的发展，人们生活水平迅速提高，医疗条件大幅改善，传统传染性疾病如疟疾、麻疹等的发病率逐年下降。同时，由于环境的污染与不合理的生活方式，以癌症、糖尿病、心脑血管疾病等为代表的现代非传染性疾病的发病率与死亡率正逐年攀升。现代疾病的复杂性和多样性对药物先导化合物的种类提出了更高的要求。糖药物作为一类重要的生物大分子药物，因其分子量大、结构复杂等特点而远远滞后于小分子药物的发展。但近年来，随着分析技术的发展，大量以糖类为先导化合物的新药被发现，糖类药物也因此成为了继蛋白质类药物后另一个潜力无限的新药宝库。如2018年7月治疗阿尔茨海默症的新药“甘露寡糖二酸”顺利完成Ⅲ期临床试验，这标志着该药的研发已迈过了最为关键的一步，也表明糖类作为一类新的先导化合物在未来药品的研究中发挥着不可替代的作用[1]。

　　1 糖药物与质谱技术

　　广义的糖药物是指以糖结构为骨架或以糖结构为修饰的药物。包括仅含糖分子的“多糖类药物”(如肝素、甲壳素等)，作为多数药用植物活性成分的“糖苷类药物”(如强心苷、黄芪皂苷等)，以糖蛋白、糖脂为代表的“糖缀合物类药物”(如单克隆抗体、人胎盘脂多糖等)，非酶糖基化反应得到的“拟糖复合物”(如糖疫苗等)[2]。区别于小分子药物，糖药物的复杂性给其定性定量及安全性与疗效的评估带来了巨大的挑战，如多糖类药物中的低分子肝素具有高负电荷、分子量大、结构不均一等特征[3]，糖缀合物类药物中的单克隆抗体具有复杂的糖基化修饰，包括糖基化位点及糖型的多样性[4]。传统分析方法如高效液相色谱法难以对糖药物复杂的组分实现基线分离，对分离组分的结构解析也相对困难。红外光谱法能对部分官能团进行归属，然而所能获得的结构信息有限。核磁共振波谱法尽管能获得较为全面和细致的结构信息，但其只能表征整体结构而无法鉴定单个组分。而具有其他分析方法无可比拟的优点的液相色谱串联质谱法(LC-MS)将液相良好的分离能力和质谱高分辨率、高灵敏度结合，可以完成对糖药物各组分及其碎片分子量的测定，从而实现对其精细结构的表征。

　　质谱分析是一种通过测量离子质荷比(质量与电荷之比)从而确定质量进而推算分子结构的分析方法。质谱仪由进样系统、离子源、质量分析器和检测器等部分组成，其中离子源和质量分析器是核心部分。离子源包括软电离和硬电离两类。在糖药物分析中广泛使用的是软电离方式，如电喷雾电离(electrospray ionization, ESI)和基质辅助激光解析电离(matrix assisted laser desorption ionization, MALDI)[5-6]。质量分析器可分为高分辨与低分辨两类。由于糖药物结构的复杂性，高分辨的质量分析器如轨道阱质量分析器(orbitrap)和飞行时间质量分析器(time of flight, TOF)等被广泛应用于其结构的分析。通过软电离源与高分辨的质量分析器，可以确定糖药物组分的精确分子量，从而计算其糖单元组成和数量、取代基情况等。如果需要对糖链的结构进行更深入的鉴定，如糖链的连接顺序、连接位点、分支情况和取代基的具体位置等，则需要用到多级质谱。在多级质谱中，通过碰撞诱导解离(collision induced dissociation, CID)、电 子 转 移 解 离(electron-transfer dissociation， ETD)及高能碰撞解离(higher-energy collisional dissociation, HCD)等不同碎裂方式使特定的母离子碎裂，再对碎裂得到的子离子进一步解析，可实现糖类药物的序列测定和同分异构体的区分等。此外，三重四极杆质量分析器(triple quadrupole)所 特 有 的 多 反 应 监 测 模 式(multiple reaction monitoring, MRM)通过过滤背景离子可显著提高定量的选择性和准确度，适用于糖药物关键组分的定量分析。由于质谱技术可以很方便地与气相色谱和液相色谱等技术实现联用，更加促进了其在糖药物分析中的应用。

　　2 质谱在糖药物结构表征方面的技术进展

　　2 .1 质谱在多糖类药物结构表征方面的技术进展

　　多糖类药物根据所带电荷可分为带正电荷的多糖(如甲壳素)、带负电荷的多糖(如肝素、硫酸软骨素和透明质酸等糖胺聚糖)以及中性多糖等。肝素(图 1)是最具有代表性的多糖药物，其全球市场规模超过 120 亿美元 / 年。肝素由己糖醛酸(β-D- 葡萄糖醛酸或 α-L- 艾杜糖醛酸)和葡萄糖胺通过 1-4 糖苷键连接形成的二糖重复单元连接而成。己糖醛酸可能会发生 2-O- 硫酸化，而葡萄糖胺可能会发生 6-O- 硫酸化、3-O- 硫酸化、N- 硫酸化及 N- 乙酰化。肝素作为抗凝血药物具有超过 80 年的临床使用史，为了提高其生物利用度、降低临床副作用，之后又出现了各种低分子量肝素药物。依据降解工艺的不同，低分子肝素可分为依诺肝素钠、达肝素钠、那曲肝素钙、帕肝素钠和汀肝素钠等。不同的低分子肝素品种具有各自的结构特征及临床适应证。

　　由于低分子肝素的组成和结构十分复杂，往往需要用到多种质谱技术从不同的角度对其进行分析，常用的策略包括自上而下分析(top-down)和自下而上(bottom-up)分析(图2)。自上而下的分析指不经降解处理直接对低分子肝素进行液相色谱质谱分析，如Linhardt实验室开发了一种基于亲水相互作用色谱(HILIC)与质谱联用的方法分析低分子肝素的完整糖链指纹图谱，解析了各糖链组分的链长、末端结构、硫酸基和乙酰基的取代数目等，并根据质谱信号强度计算各组分的相对含量[7]。笔者课题组开发了反相离子对色谱质谱联用的方法，对依诺肝素钠和那曲肝素钙分别进行了完整糖链的分析，共鉴定到140多种依诺糖链结构和80多种那曲糖链结构，还可以灵敏地检测到产品中的副反应产物[8]。利用多级质谱技术，还可以实现对低分子肝素中糖链的直接测序[9]。自下而上的分析是指通过酶解或化学降解的方法把低分子肝素充分降解成基本的二糖组成单元或部分降解成寡糖片段，再用液相色谱质谱法进行分析。由于质谱既可以检测到没有紫外吸收的组分，又可以发现没有对照品的新结构，可以鉴定到的低分子肝素衍生二糖或寡糖的数目远远超过以往的认识。目前最全面的质谱分析方法可以鉴定并定量约50种依诺肝素钠的基本组成单元[10]。从肝素酶II降解的低分子肝素寡糖片段混合物中，也可以鉴定并定量超过40种寡糖片段，这些寡糖片段可以作为评价多糖序列的间接证据[11]。

　　2.2 质谱在糖缀合物类药物结构表征方面的技术进展

　　在糖缀合物类药物中，糖蛋白药物是尤为重要的一类。在糖蛋白药物中，最具代表性的是以γ型免疫球蛋白G(IgG)为基础的单克隆抗体类药物。单克隆抗体(图3)是由两条轻链及两条重链通过二硫键连接组成的四聚体，其中每个轻链由一个可变区(VL)和一个恒定区(CL)组成，而每条重链由一个可变区(VH)和3个恒定区(CH1、 CH2和 CH3)组成。连接两条重链的铰链区经水解后可分为含有抗原结合位的Fab区和易结晶的Fc区[12]。大部分单克隆抗体的Fc区CH2处的Asn297氨基酸残基上有一个N-糖基化位点，此处的糖基化修饰位于两个CH2之间，由于空间限制了其糖链分支的延伸，故该处最常见的糖型为双天线结构并大多伴有核心岩藻糖基化。约20%的单克隆抗体会在Fab区存在另外一个N-糖基化位点，如西妥昔单抗的CH1处 Asn88氨基酸残基上就发生了N-糖基化[13]。另外单克隆抗体还可能发生O-糖基化修饰[14]。

　　由于单克隆抗体包括蛋白质主体和糖链修饰两部分，对其全面的结构表征包括对蛋白质的表征和对糖的表征。蛋白质的全谱分析包括 ：蛋白质分子量的测定(完整分子量及轻链、重链的分子量)、氨基酸序列的测定、二硫键的位置及蛋白质空间的结构等[15-17]。对糖的表征包括糖基化位点的鉴定(N- 糖基化位点和O-糖基化位点)及糖型的表征。N-糖基化位点的鉴定可以借助糖苷酶，如采用β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶切割糖苷键时，会留下一个GlcNAc 残基附着在蛋白质上，使肽段增加203Da的质量标签[1 8]。而使用肽-N-糖苷酶(PNGase)在D2O中释放完整糖链，会同时将天冬酰胺残基转化为天冬氨酸残基，使肽段增加3Da的质量标签[19]。随后使用 LC-MS/MS分析检测去糖基化后的质量差异，就可以确定原始N-糖基化发生的位点。不同于N-糖基化位点，O-糖基化的发生位点难以预测，原因是O-糖链的核心结构具有异质性，目前还没有通用的内切糖苷酶被发现，导致其鉴定相对困难。Bai等[20]采用混合外切O-糖苷酶，部分移除O-糖肽丝氨酸和苏氨酸上的糖链，并留下一个GalNAc残基作为质量标签，然后利用LC-MS/MS检测203Da的质量差异来确定O-糖基化位点。糖型的分析策略包括使用 PNGase 酶释放糖链、固相萃取富集纯化糖链、荧光标记和液相质谱联用检测等步骤。如H enry等[21]报导了采用这一策略对曲妥珠单抗的糖型的分析。

　　3 质谱在糖药物新药及仿制药研发和注册方面的应用

　　3. 1 质谱在新型糖药物研发中的应用

　　人们对糖分子结构与功能的认识远远落后于核酸和蛋白质等生物大分子。近年来，随着分析技术的进步，尤其是质谱技术的发展为开发新型糖药物提供了有力的保证。岩藻糖化硫酸软骨素是近年来发现的一种重要的具有新药前景的多糖，可以作为肝素类抗凝药物的补充。这种多糖存在于海洋动物海参中，其抗凝机制与肝素不同，为抑制内源凝血通路，通过质谱等技术可以鉴定这种糖链的基本结构[22]。而通过尖端的离子回旋共振质谱技术，可以更为精细地鉴定这类新型糖链的精细结构[23]，从而为其成药性研究提供结构基础。

　　蛋白质组学技术，尤其是糖组学技术，是质谱在新药研究领域中的另一个重要应用。人体内超过 50%的蛋白质会发生糖基化修饰，而与疾病发生发展密切相关的生物标志物蛋白的糖基化比例往往更高。基于质谱技术的糖组学分析可以比较病人与健康人样本间的差异，从而发现生物标志物糖蛋白，提供新药开发的靶点[24]。除了结构鉴定外，质谱还可以用于大分子的空间相互作用分析。如Li等[25]利用氢氘交换质谱技术分析了不同单克隆抗体对肿瘤标志物糖蛋白糖基化修饰的不同响应及相关的抗原表位，有助于指导单克隆抗体药物的深入优化。

　　3.2 质谱在糖药物仿制和报批方面的应用

　　由于糖链的不均一性，在糖药物仿制药的结构一致性评价时，很难采用小分子化学药物的分析方法。通常需要更多地使用各种质谱技术，尽可能全谱表征其整体结构和各糖链组分结构。以低分子肝素为例，2010年，Sanofi公司的依诺肝素钠专利到期，随后美国的Sandoz公司成功仿制了这一品种，并借助质谱等分析技术证明了其仿制药与原研药在结构上的一致性。美国FDA就这一事件出台了低分子肝素仿制药一致性评价的指导意见，强调了应对产品的完整糖链分布、二糖基本组成单元、寡糖指纹图谱和糖链序列等方面进行细致的结构确证和比较。而满足这些结构分析要求，质谱技术是不可或缺的[26]。单克隆抗体等糖缀合药物的仿制和评价需要遵循生物相似性(biosimiliar)原则[27-29]。对于糖链修饰部分，需要通过质谱技术来表征糖基化位点和糖型并与原研药进行比较。

　　4 总 结

　　随着现代疾病的复杂化和多样化，局限来源的先导化合物已经不能满足人们对疾病的预防和治疗的需求，糖药物作为一类新的先导化合物在未来人类疾病治疗中起到不可或缺的作用。中国生物医药企业想要抢占药物产业升级的先机，就应重视糖药物的研发和仿制。结构鉴定和表征是糖药物研发的一个瓶颈，而质谱技术，尤其是糖的质谱分析，需要非常强的专业性。因此建设专业化的糖分析质谱平台，培养更多的相关专业人才，建立更多的糖分析相关标准，将有利于推动我国糖产业的技术变革和优化升级。

　　期刊推荐：《质谱学报》(双月刊)创刊于1980年，由中科院北京科学仪器研制中心主办。刊登物理、化学、生物化学、材料学、核科学、地球科学、生命科学等基础学科中质谱法的新理论、新方法、新技术及其在各领域的应用研究成果，同时介绍质谱学及其相关技术在上述前沿课题研究中的最新进展。

《质谱技术表征糖药物结构的前沿进展》

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