N-端修饰提高D-氨基酸氧化酶的表达酶活

　　摘要：通过提高DAAO的酶活来进一步提高本研究的多酶转化体系的转化效率。本章通过对来源于Rhodosporidiumtoruloides的DAAO（RtDAAO）的N-端进行研究，并通过一系列的改造和修饰，提高了RtDAAO在E.coli中的可溶性表达，同时又保证了宿主细胞的生长，以便于表达后重组菌的收集和多酶级联体系的制备。

　　关键词：N-端；DAAO；酶活

　　1.多酶级联体系转化过程速率分析

　　为了准确建立数学模型，对转化过程中涉及的反应速率及相应的底物及产物必须进行详细的分析。如图1所示，本文研究的级联转化体系涉及四个酶，五个反应速率过程。根据反应体系设计，整个反应过程主要分为两步，第一步所用的酶为D-氨基酸氧化酶（DAAO）和过氧化氢酶（CAT），混旋底物中的D-正缬氨酸经DAAO氧化生成前手性物2-氧代戊酸。DAAO的反应过程除了底物涉及到辅酶FAD用于氢负离子的传递，同时需要氧气重新氧化FADH2，使得DAAO具有活性，重新加入反应过程中。其中FAD与酶紧密结合，不需要外源添加，因此氧气的供应对DAAO的活性具有重要的意义，是本反应需要考虑的重要因素之一。而氧气的供应受到从气体到液相的传质的限制，所以DAAO的酶活提高与底物氧化的速率提高的幅度才出现了不对等的情况。CAT的作用是用于消除反应副产物H2O2，同时也能够回收一部分氧气直接参与DAAO的反应。所以，如图第一步涉及的反应速率记为r1和r2。第二步所用的酶是亮氨酸脱氢酶（LDH）和甲酸脱氢酶（FDH），这一步涉及三个反应速率记为r3，r4和r5。LDH在催化酮酸的不对称还原胺化反应属于可逆反应，虽然反应平衡倾向于合成氨基酸方向，为了准确描述转化过程，其逆反应也是需要考虑在内，所以需考虑r3和r4。FDH用于合成辅酶NADH，与亮氨酸脱氢酶形成辅酶循环，使得反应得以进行，因此对于转化过程的描述也需要考虑其反应速率r5。从整体的转化来看，本文研究的转化体系涉及到很多副产物小分子的体系内回收利用，如氧气、NH3及辅酶NADH等。

　　2.动力学参数

　　在建立动力学模型的基础上，为了使该模型能够得到应用，需要进一步测定模型中的所有动力学参数。同时，参数测定的准确性也会影响到模型描述转化过程的准确性及其预测结果。因此，所有参数的测定条件是在L-正缬氨酸的最佳转化条件下进行的。利用初始速率法测定动力学参数，涉及反应的化合物对初始速率的影响均被测量。DAAO的动力学测定数据及方程拟合，可以看出产物2-氧代戊酸对DAAO的抑制。同时，DAAO不受底物D-正缬氨酸的对应异构体的抑制。该反应可以回收部分氧气。LDH催化的可逆反应是本体系转化的第二步反应，可以看出，正向反应不仅受到产物的竞争性抑制，同时高浓度底物对其也有抑制作用，因此转化体系最好不要有过多的中间产物2-氧代戊酸的积累。由于反应平衡偏向于正向反应，所以产物L-正缬氨酸的氧化脱氨基本可以忽略不计。最后是辅酶NAD再生循环的反应速率，其大小影响到了LDH的正向反应，因此，在转化体系中具有重要的作用。

　　3.模型的准确性验证

　　模拟结果中D-正缬氨酸的消耗曲线基本能够很好的与实验数据相拟合。同时模拟结果也显示了转化过程中间产物2-氧代戊酸的积累，由于实验测量无法实时监控，所以并不知道中间产物在哪个时间点达到最大积累量。然而模型模拟可以显示在D-正缬氨酸刚被消耗完也就是转化时间不到2h的时候，中间产物的积累达到最高峰。该结果可以看出由于DAAO快速氧化D-正缬氨酸导致2-氧代戊酸大量合成，而转化体系第二步由于NADH供应不足来不及胺化还原第一步产生的2-氧代戊酸，使得中间产物逐渐积累并在底物消耗完的时间左右达到了最高峰。因此，想要进一步提高体系的转化效率，关键是提高转化体系第二步的效率，也就是提高FDH的酶活，加强NADH的供应。通过N-端修饰提高了DAAO的酶活而的转化速率却没有获得相应比例的提高，是由于转化过程中存在制约因素即氧气的供应。因此，在提高FDH酶活前，需要通过模型进行预测，根据预测结果来提高FDH的酶活，避免过多的提高导致无用的活性。

　　4.模型预测

　　综合上述对体系不同酶量组别转化组别的分析可知，目前体系中甲酸脱氢酶酶活无法达到最佳转化的条件，同时也计算得出在有充足的DAAO和LDH条件下，FDH在体系中酶活至少要达到4.67×102U/L，同时，进一步提高FDH的酶活，则DAAO和LDH的活性可以适当的降低但是要保证位于预测的范围。所以，最佳体系还需根据改造后FDH的最终酶活进行调整。

　　5.结论

　　据测得的参数数值使用模型，模拟得到的结果与在相同条件下的L-正缬氨酸的转化过程的实验数据基本吻合，证明本研究所构建的数学模型能够准确地描述L-正缬氨酸的转化过程，可以用来预测L-正缬氨酸转化从而指导多酶级联体系中酶表达比例的优化。

　　利用已验证的数学模型模拟预测不同DAAO和FDH酶量体系的转化速率及过程中间产物积累量得到最佳转化体系要求DAAO和FDH的范围和两者的最少酶活。同时，也预测了不同LDH和FDH酶量体系的转化速率及转化结束中间产物含量来进一步得到高转化率和转化效率的体系。综合两组预测，FDH的最低酶活为4.67×102U/L，同时模拟得到的酶活范围表明，最佳体系中DAAO和LDH的酶活可以随FDH的酶活提高而适当降低。

　　参考文献

　　[1]张俊,胡宏岗等.L-正缬氨酸不对称合成研究[J].第二军医大学学报,2008,29(3):324-325.

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