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甘油和二甲基亚砜溶液低温冷藏蚕卵的效果

来源:职称论文发表咨询网作者:田编辑时间:2020-12-07 08:42

  摘 要 甘油和二甲基亚砜(简称“DMSO”)作为低温保护生殖细胞的保护剂,是否能够增强蚕卵的抗冻能力和延长蚕种保护期未见报道​‍‌‍​‍‌‍‌‍​‍​‍‌‍​‍‌‍​‍​‍‌‍​‍‌​‍​‍​‍‌‍​‍​‍​‍‌‍‌‍‌‍‌‍​‍‌‍​‍​​‍​‍​‍​‍​‍​‍​‍‌‍​‍‌‍​‍‌‍‌‍‌‍​。为探究甘油或DMSO对蚕卵保存的效果,以大造蚕品种的即时浸酸卵、赤豆色卵及深赤豆色卵为材料,分别将蚕卵放入水及5%、10%、15%三种不同浓度的甘油和DMSO中保存,空白对照组不加任何东西,分别置于4 ℃和0 ℃条件下保存。实验结果为:(1)即时浸酸卵,在4 ℃下放入5% DMSO保护剂中冷藏效果最佳,主要体现在冷藏20d、30 d、40 d、50 d的孵化率比对照组分别高12.05%、40.35%、334.78%、142.86%;在0 ℃下放入5% DMSO保护剂中冷藏效果最佳,主要体现在冷藏20 d、30 d、40d的孵化率比对照组分别高4.30%、33.33%、100%。赤豆色卵,在4 ℃下放入水和5% DMSO保护剂中冷藏效果较佳,在0℃下以5%甘油保护剂冷藏效果较佳,但比对照组的效果差。深赤豆色卵,在4 ℃下放入5% DMSO保护剂冷藏效果最佳,在0 ℃下以水和10%DMSO保护剂中冷藏效果最佳。(2)即时浸酸卵和赤豆色卵冷藏,4 ℃保护效果最佳;深赤豆色卵冷藏,0 ℃保护效果最佳。(3)对于即时浸酸的蚕卵,加了保护剂的孵化率高于对照组;对于赤豆色卵,保护剂对其效果不明显;而对于深赤豆色卵,随着冷藏天数的增加,保护剂的效果逐渐明显。

  关键词 蚕卵;甘油;二甲基亚砜;防冻剂

  中图分类号:S884 文献标识码:A 文章编号:2095-1205(2020)09-01-05

甘油和二甲基亚砜溶液低温冷藏蚕卵的效果

  1 前言

  1.1 蚕种保存现状

  我国作为拥有悠久历史的蚕桑大国,家蚕种质资源丰富,为家蚕遗传育种和遗传学研究提供了良好素材。为避免种质资源消失,建立种质资源库显得尤为重要,而研究家蚕种质资源保存对蚕业可持续发展具有重要意义。

  蚕种冷藏是蚕种保护工作的重要措施,生产上蚕卵冷藏的方法主要有滞育卵冷藏法、不完全滞育卵冷藏法、冷藏浸酸种浸酸后的冷藏抑制处理及即时浸酸种浸酸后冷藏等。滞育卵冷藏的方法有单式冷藏和复式冷藏。广东多采用单式冷藏,少数地区采用复式冷藏。单式冷藏适合在用种期不超过140 d的情况下采用,复式冷藏一般在用种期不超一年的情况下采用。如遇到蚕种供应有余,为减少损失,则采用复式冷藏。不完全滞育卵的冷藏方法如下:蚕卵产后在25 ℃、相对湿度75%~80%的条件下,经过45~62 h(2~3 d),卵色处于赤豆色到深赤豆色之间,此阶段的蚕种可冷藏50~70 d。蚕卵产后在25 ℃、相对湿度75%~80%的条件下,经过72~120 h(3~5 d),卵色处于深赤豆色到固有色之间,此阶段的蚕种可冷藏80~90 d。冷藏浸酸种浸酸后的冷藏抑制处理方法如下:浸酸后的蚕种在25 ℃条件下经过20~24 h,胚子发育到丙1至丙2阶段时,经中间温度13~15 ℃保护2 h后移入内库以5 ℃冷藏,冷藏限期为30d左右[1]。

  1.2 胚胎动物的保护研究

  为保持物种的多样性,物种的生殖细胞保存这一项工作十分重要。低温保存生殖细胞可以抑制细胞的发育,使用保护剂可增强细胞的抗冻性、保持细胞的活性,在需要用细胞时解冻便可以恢复其活性,让其继续发育生长。文献资料显示,目前低温保护生殖细胞的保护剂主要有甘油、二甲基亚砜、海藻糖、乙二醇。这些保护剂主要用于畜牧、水产、生命科学等方面研究。

  畜牧方向,郝爱玲等[2]取公牛鲜精液,在4 ℃环境下加入甘油溶液保存6 d,从而筛选出有利于牛鲜精4℃保存的最佳甘油浓度为4%;王世银等[3]使用2%、4%、6%、8%四种浓度的甘油、乙二醇和DMSO作为保护剂,将其添加至鸡精液,结果显示浓度为6%的甘油对鸡精液冷冻保存的保护效果最好,且保护剂组合甘油+DMSO组冷冻保存的效果略好于其他组。

  水产方向,丁淑燕等[4]取兴国红鲤精子加入8% DMSO保护剂,保存于-196 ℃液氮中,在37℃水浴锅里水浴100 s解冻,冻存前后的精子密度和活动率均无明显差异;程顺等[5]在超低温环境下冷冻保存大黄鱼精子,以甘油为保护剂,结果显示以5%~20%甘油保护剂保存大黄鱼精子的效果较佳,其中甘油浓度为10%时效果最佳。

  生命科学方向,邵同先等[6]取8份志愿者的精液冻存(-196 ℃)10 d,加入复方甘油保护剂,精液解冻激活后镜检,精子活力接近鲜精的水平;齐映亮等[7]选取健康羊膜分为4组,A组为空白对照组,B组为DMEM/甘油/ DMSO/海藻糖组,C组为DMEM/甘油/DMSO组,D组为DMEM/甘油组,冷冻保存后与新鲜羊膜比较,实验结论为DMEM、甘油、DMSO、海藻糖可作为新型保护剂用于精液深低温高活性保存。

  从以上实验可以看出,甘油和DMSO都具有抗冻能力,且增强了动物鲜精和健康羊膜的抗冻性;甘油和DMSO能在-196 ℃的超低温条件下保护生殖细胞;甘油和DMSO混合使用也具有抗冻性;冷藏后的鲜精需水浴解冻。实验证明,甘油和DMSO对血细胞、动物鲜精低温保存有一定的作用。之所以选取甘油或DMSO作为保护液,是因为甘油是最早、最传统的防冻液,主要运用于植物、动物胚胎、昆虫的低温防冻,或制造业的除冻剂。10%的甘油水溶液冰点为-1.6 ℃,30%的甘油水溶液冰点为-9.5 ℃。DMSO是一种含硫有机化合物,能够降低细胞冰点,抑制细胞程序性死亡[8]。纯DMSO的冰点是18.45 ℃,含水40%的DMSO在- 60 ℃不冻,且DMSO遇水、雪混合时会放热。因此DMSO可作涂料等的保护剂,汽油、航煤的防冰剂,以及骨髓、血液、细胞低温保存的保护剂等[9]。

  1.3 研究目的及意义

  蚕农根据历年的养蚕数量、市场的需求制订下一年的用种计划,为适应用种计划,20世纪80年代开始了蚕种冷藏浸酸技术研究。蚕种冷藏的主要作用是解除蚕卵滞育和抑制蚕卵的发育,以便结合养蚕计划适时出库催青,确保蚕种的孵化率及蚕发育的质量,待保护一定的时间后,通过浸酸的方法来解除滞育。然而生产过程中蚕种发放的规律性极差,常会遇到蚕种冷藏超过期限或者提前出库的问题,这样会导致其成为超期蚕种或者在浸酸时造成蚕卵的浪费,不利于蚕种的供应。因此,生产上需要更灵活的技术方法去适应长期大量养蚕的蚕种需求,冷藏浸酸技术需要更多样性才能适应生产的需求。

  经文献查阅,目前仅有关于甘油或DMSO对动物生殖细胞的保存研究,未见对蚕卵的保存等相关研究文献。Jun Kusu等[10]将家蚕五龄幼虫卵巢器官芽取出,用不同浓度的甘油处理,在液氮中保存。将解冻后的卵巢移植到五龄雌幼虫体内,根据寄主发育情况,五龄雌幼虫的卵巢中有20%以上发育成带卵壳的成熟卵。通过孤雌生殖激活,成熟卵开始胚胎发育,孵化出幼虫。孵化出的幼虫和正常的幼虫一样完成了胚胎后发育。以上实验说明,甘油对家蚕低温保存有一定的作用。为进一步探索甘油、DMSO对蚕卵保存的效果,初步筛选出甘油和DMSO保存蚕卵的条件,期望找出延长保存蚕卵的材料及方法,为蚕种冷藏保护研究提供数据依据。

  2 材料与方法

  2.1 材料

  1.蚕卵品种

  大造蚕卵,由华南农业大学蚕丝科学系提供。

  2.试剂

  甘油(由广州化学试剂生产)、DMSO(由天津市大茂化学试剂厂生产)、纯净水。

  3.设备

  LRH-250 -HS恒温恒湿培养箱、松下NR-C320 WP- S三门变频风冷无霜节能多门大冰箱。

  2.2 方法

  1.试验处理

  家蚕在常规条件下饲养和保护,取其母蛾产的蚕卵,分三种处理。

  (1)即时浸酸卵。将母蛾产下的卵置于25 ℃、相对湿度75%~85%的环境保护约20 h后,取蚕卵样品进行即时浸酸,盐酸比重为1.075,液温为46 ℃,浸酸4.5 min;用流动水冲洗脱酸约30 min,晾干;将蚕卵随机分为8 份,每份设3个重复;在管内分别加入水、5%甘油、10%甘油、15%甘油、5% DMSO、10% DMSO、15%DMSO,或不添加任何东西(作为空白对照组);将放有蚕卵的管分别在4 ℃、0 ℃的条件下保存;定期(每隔10 d)将蚕种样品取出​‍‌‍​‍‌‍‌‍​‍​‍‌‍​‍‌‍​‍​‍‌‍​‍‌​‍​‍​‍‌‍​‍​‍​‍‌‍‌‍‌‍‌‍​‍‌‍​‍​​‍​‍​‍​‍​‍​‍​‍‌‍​‍‌‍​‍‌‍‌‍‌‍​。

  (2)赤豆色卵。将蚕卵置于25 ℃、相对湿度75%~85%的环境保护,蚕卵发育至赤豆色时,取蚕卵样品,将蚕卵随机分为8 份,每份设3个重复;在管内分别加入水、5%甘油、10%甘油、15%甘油、5% DMSO、10% DMSO、15%DMSO,或不添加任何东西(作为空白对照组);将放有蚕卵的管分别在4 ℃、0 ℃的条件下保存;从第40 d开始,定期(每隔10 d)将蚕种样品取出。

  (3)深赤豆色卵。将蚕卵置于25 ℃、相对湿度75%~85%的环境保护,当其发育至深赤豆色时,取蚕卵样品,随机分为8份,每份设3 个重复;在管内分别加入水、5%甘油、10%甘油、15%甘油、5% DMSO、10% DMSO、15%DMSO,或不添加任何东西(作为空白对照组);将放有蚕卵的管分别在4 ℃、0 ℃的条件下保存;从第80 d开始,定期(每隔10 d)定期将蚕种取出。

  2.冷藏后的处理

  取出蚕卵,用恒温水浴锅在37 ℃下解冻10 s,分别洗净甘油和DMSO,晾干。即时浸酸卵晾干,放入25~26 ℃、相对湿度75%~80%的恒温恒湿人工气候箱中催青至孵化;而赤豆色卵和深赤豆色卵采用冷藏浸酸法进行浸酸,盐酸比重为1.092,液温为47.8 ℃,浸酸5min。取出蚕卵在流动水中冲洗约30 min,晾干,放在25~26 ℃、相对湿度75%~80%的恒温恒湿人工气候箱中催青至孵化。

  3.计算孵化率

  计算实用孵化率。

  2.3 数据分析

  本研究采用IBM SPSS Statistics 22.0软件进行多因素方差分析,使用邓肯氏新复极差检验法(DMRT法)进行多重比较。

  3 结果

  3.1 即时浸酸卵用不同保护剂保存的效果

  即时浸酸卵用不同浓度的保护剂保存,实验结果如表1。总体上看,4 ℃下冷藏的蚕卵效果较0 ℃的好;加了保护剂的蚕卵孵化率高于空白对照组,随着冷藏时间的增加,孵化率逐渐降低;4 ℃和0 ℃下冷藏10 d的效果最佳,孵化率均在93%以上,特别是温度在4℃时,孵化率为100%。4 ℃冷藏30 d,5%甘油、10%甘油、5%DMSO及10%DMSO的孵化率都在80%以上,比空白对照组分别提高了52.63%、52.63%、40.35%、45.61%。4℃下,5% DMSO保护剂的冷藏效果是最好的,主要体现在冷藏20 d、30 d、40 d、50d的孵化率比空白对照组分别提高了12.05%、40.35%、334.78%、142.86%;0℃下,5% DMSO、10% DMSO保护剂的冷藏效果最好,对于5% DMSO来说,冷藏20 d、30d、40 d的孵化率比空白对照组分别约提高了4.30%、33.33%、100%,对于10%DMSO来说,冷藏30 d、40 d的孵化率比空白对照组分别约提高了16.67%、76.67%。特别是4 ℃下,加水冷藏10~80 d的蚕卵一直都有孵化,只是孵化率低,孵化率最高出现在冷藏10 d,为100%;孵化率最低出现在冷藏70~80 d。

  3.2 赤豆色卵用不同保护剂保存的效果

  赤豆色卵用不同浓度的保护剂保存,实验结果如表2。总体上看,加保护剂的蚕卵孵化率均达不到实用孵化率要求。4 ℃冷藏的蚕卵孵化率较0 ℃的高,但随着冷藏时间的增加,孵化率逐渐降低,冷藏50 d的效果最佳;对于4 ℃来说,空白对照组的孵化率高于加了保护剂和水的,所以保护剂在4℃的冷藏中效果不佳,其中水和DMSO的效果较其他保护剂好,冷藏40 d以5% DMSO较好、冷藏50 d以10%DMSO较好,但变化规律不显著;对于0 ℃来说,冷藏50 d的效果最佳,且用5%甘油保存孵化率达到83%,其中40~60 d,加了5%甘油保护剂的蚕卵保存效果最佳,而70~80 d,空白对照组和加水保存的孵化率逐渐增加明显,空白对照组的孵化率从10%增加到73%,加水保存的蚕卵孵化率从7%增加到50%。

  4 讨论

  4.1 不同试剂保护

  对于不同方法处理的蚕卵、不同时期的蚕卵,分析数据可得DMSO保护剂的冷藏效果更佳、水次之。即时浸酸卵,4 ℃下,5% DMSO保护剂冷藏效果最佳,0 ℃下,10% DMSO保护剂冷藏效果最佳;赤豆色卵,4 ℃下,水和5% DMSO保护剂冷藏效果较佳,0 ℃下,5%甘油保护剂冷藏效果最佳;深赤豆色卵,4 ℃下,5% DMSO保护剂冷藏效果最佳,0 ℃下,水和10%DMSO保护剂冷藏效果最佳。

  4.2 不同温度保护

  对于即时浸酸卵和赤豆色卵来说,4 ℃保护效果最佳;对于深赤豆色卵来说,0 ℃保护效果最佳。温度对不同发育时期胚胎的保存效果存在差别,这可能与胚子耐低温能力有关,有待进一步研究。

  5 结论

  对于用甘油和DMSO处理的蚕卵,赤豆色蚕卵使用冷藏的效果不明显,而深赤豆色蚕卵随着冷藏天数的增加,使用保护剂有一定效果,但孵化率没有达到生产上实用孵化率90%以上要求,但对种质资源的保护保存仍具有一定科学意义。而对于已经解除滞育的蚕卵来说,保护剂具有一定的作用,特别是DMSO,增强了蚕卵的抗冻性?加水保存的蚕卵是否增强了抗冻能力尚待进一步研究。

  参考文献

  [1]徐兴耀,林健荣.吴泉,等.广东蚕桑生产传承与创新技术[M].北京:中国农业科学技术出版社,2014:108-113.

  [2]郝爱玲,阿淑艳,郑伟,等.不同甘油浓度对牛鲜精低温保存的影响[J].中国奶牛,2007(10):33-34.

  [3]王世银,张伟,张兆旺,等.抗冻剂对鸡精液冷冻效果的影响[J].江苏农业科学,2011,39(3):260-262.

  作者刘景瑞1 薛彬静1 王 飞2 王叶元1 严会超1

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