无机纳米材料在骨组织工程与再生医学中的应用

　　摘要 自组织工程与再生医学概念提出以来, 组织工程与再生医学特别是骨组织工程与再生医学得到了突飞猛进的发展. 支架材料作为骨组织工程与再生医学三要素之一扮演着至关重要的角色. 10余年来, 大量的研究工作围绕支架材料展开. 纳米生物材料尤其是无机纳米生物材料, 具有优良的机械性能和生物相容性, 成为制备骨组织工程与再生医学支架材料的理想选择, 呈现出广阔的应用前景. 本文对近年来无机纳米材料, 包括羟基磷灰石、硅基纳米材料, 含碳纳米材料及几种金属纳米材料在骨组织工程与再生医学中的应用进行综述.

　　关键词 无机纳米材料, 骨组织工程与再生医学, 支架

　　在全球范围内, 众多骨损伤患者每年都遭受着病痛的折磨, 而造成骨损伤的原因很多, 如年龄、运动、疾病和创伤等. 自19世纪以来, 自体骨或异体骨材料体内移植一直是人们用来修复大面积骨损伤的方法, 然而这些材料自身就存在着不可忽视的缺陷. 自体骨移植虽易被患者接受, 但是会给患者造成新的创伤和痛苦, 异体骨材料虽然取材方便, 但是存在疾病传播和免疫排斥的风险, 从生物安全上很难达到令人满意的修复效果[1~3]. 骨组织工程与再生医学在这种背景下应运而生, 给骨修复带来新的期盼. 骨组织工程与再生医学是通过“智能”操控种子细胞、支架材料和生长因子来模拟天然骨组织的微环境从而促进骨母细胞的增殖、分化及细胞外基质形成, 最终实现骨重建[4]. 其中支架材料是骨组织工程与再生医学的关键, 同时也是研究力量投入最多的方向, 一方面其作为载体将种子细胞及生长因子运送至损伤部位, 另一方面支撑着新骨的生长. 目前, 在临床治疗中人工制备的材料用作硬组织修复材料越来越广泛, 因此硬组织修复材料成为了临床需求的最大领域之一, 而材料研发成为生物医用材料发展最重要的一个方向. 理想的人工骨修复替代材料应具备以下特性[5]: (1) 优良的机械性能; (2) 良好的可加工性和临床操作性; (3) 较好的生物学特性或可降解性; (4) 良好的骨传导性和诱导性. 人工骨修复材料的发展按其演变历程简单分为3个阶段[6]. 第1阶段: 20世纪 60~70年代, 主要是第一代生物材料, 如部分骨衍生材料、金属材料、生物陶瓷等, 这一代生物材料对宿主的应答较小; 第2阶段: 20世纪80年代, 生物活性玻璃(Na2O-CaO-P2O5-SiO2)、羟基磷灰石(HA)等, 并研究出了生物体可吸收材料, 最终被再生出的组织替代, 如HA/聚乳酸(PLA)复合材料等. 第2代生物材料缺乏生物化学刺激的响应性, 因此降低了其使用功能, 缩短了其寿命; 第3阶段: 20世纪90年代至今, 各类复合材料特别是无机复合材料取得了长足发展, 并且随着纳米学、材料学、细胞生物学、组织工程与再生医学的发展和进步, 纳米材料和仿生材料已经成为骨修复材料的主要发展趋势.

　　纳米骨修复材料是一类由人工合成、具有多种优良理化特性(如机械强度高、比表面积大等)和生物学特性(如生物相容性好、可降解、能诱导骨细胞和血管生长等)的新型骨修复材料. 近年来, 用于骨组织修复的主要有无机材料(羟基磷灰石、纳米陶瓷、无机金属等)、纳米聚合物、纳米仿生骨等. 其中, 无机材料因其具有强度好、加工方便、较好生物学特性等优点使其具有广阔的应用前景[7~9]. 另外, 由于天然组织或者器官是通过细胞与纳米尺度的细胞外基质相互影响而形成的, 那么纳米材料的生物仿生性及生化特性对于促进细胞生长及诱导组织重建至关重要. 为了较好模拟细胞外基质的结构, 无机材料被设计成不同形貌, 如纳米纤维、纳米管、纳米颗粒及水凝胶等, 用于细胞外基质的重组[10]. 本文以无机纳米材料为重点, 详细介绍了羟基磷灰石纳米材料、硅基纳米材料、碳纳米材料及多种无机金属纳米材料在骨组织工程与再生医学中的应用.

　　1 纳米羟基磷灰石在骨组织工程与再生医学中的应用

　　纳米羟基磷灰石(nanohydroxyapatite, nHA)是天然骨骼中主要的无机成分, 是一种具有代表性的生物活性材料. nHA具有良好的骨传导性、生物活性、骨结和性等特点成为良好的骨修复替代材料. 近10 年来, nHA作为人工骨材料在再生医学领域中逐渐兴起. 研究人员致力于改进nHA合成策略和加工方法, 使nHA的功能多样化, 应用范围广泛化. 各种各样的 nHA相继出现, 如单一的nHA支架、nHA的复合材料等, 而研究这些材料的性能和应用成为当今的主题.

　　1.1 单一nHA支架

　　在骨组织工程与再生医学中, 人们将HA做成不同结构的支架材料来研究其对蛋白吸附和细胞行为的影响. nHA的微孔和介孔结构, 为细胞外基质蛋白的吸附提供了可能的位点, 影响细胞在材料表面黏附和组织生成. Zhu课题组[11]研究表明多孔的nHA有利于低分子蛋白或转录因子的吸附, 特别是孔径为 20 nm的nHA具有很强的纤维蛋白和胰岛素吸附能力. 另外, nHA支架材料表面的粗糙程度对骨细胞的活性、黏附及分化也具有很大的影响. Iwamoto等人[12]通过将nHA和多聚物混合煅烧得到HA支架. 光滑材料表面由nHA聚集而成, 其晶格间距在微米级别; 而呈凹凸材料的表面由nHA聚集后煅烧得到, 晶格间距在纳米级别. 骨细胞在光滑材料表面的黏附性能要显著好于在凹凸表面. nHA的结晶度和溶解度也会影响吸附蛋白质的浓度、pH及介质的离子浓度. John等人[13]研究显示, 低溶解度的nHA表面有助于成骨细胞(MG-63)的早期附着、贴壁和伪足延展. 而 β-磷酸三钙则会在培养基中发生溶解, 导致培养基的低Ca, Mg和碱性磷酸酶(ALP)水平, 以及高P水平, 其表面的细胞也呈碎片化. 但随着培养时间的延长, nHA和磷酸三钙均产生抑制细胞迁移和生长的作用. 其原因可能是β-磷酸三钙会快速溶解释放出磷酸根和钙离子, 而Ca2+则会再从培养基中沉淀到β-磷酸三钙上, 从而导致磷灰石结晶度的相变. 另外, nHA的不同Ca和P的比例对成骨分化也有着显著的影响. 通过酸刻蚀技术, 发现30%磷酸蚀刻可以有效地改变 Ca/P比, 并且可以加速成骨细胞MC3T3-E1的初始黏附, 增殖和分化[14]. 通过研究成骨细胞对普通nHA 和钙缺陷nHA两种材料的生物效应, 发现其对成骨细胞的活性和ALP的产生均有促进作用, 钙缺陷nHA 的成骨分化能力要显著高于普通nHA[15]. 单一nHA 支架的粒径对骨细胞的生物学功能也起到重要的调控作用. Cai等人[16]研究不同粒径的nHA对骨髓间充质干细胞(MSCs)和骨肉瘤细胞的影响, 结果表明 nHA促进MSCs的增殖、黏附, 抑制骨肉瘤细胞的生长, 尤其是尺寸为20 nm的颗粒作用效果最佳. 认为小粒径的nHA颗粒更易于促进成骨细胞的黏附、增殖、分化及生物矿化, 进而加速骨的修复. 我们课题组通过水热法合成了3种不同形貌和尺寸的缺陷发光 HA纳米/微米粒子对小鼠原代成骨细胞(OBs)的生物效应, 发现其通过胞内和胞外两条途径共同作用促进OBs矿化. 短棒(直径为25 nm, 长度为30~50 nm)和长棒(直径为25 nm, 长度为70~110 nm)通过大胞饮和穴样内陷途径进入OBs, 定位于溶酶体, 在酸性环境下释放出Ca2+, 为细胞矿化提供了Ca2+源. 而棒状HA自组装成的微米级刺球(直径为5~6 μm)则无法进入细胞[17]. 不过细胞外的3种nHA颗粒均可以作为矿化核, 同样促进原代成骨细胞的矿化.

　　为了模拟支架降解后产生的微小纳米粒子对 BMSCs成骨分化的影响. 本课题组[18]合成出长约100 nm、宽约40 nm的长棒状结构的nHA, 以模拟支架降解后产生的微小纳米粒子对BMSCs成骨分化的影响. 研究发现nHA被细胞内吞后进入溶酶体, 在酸性环境中逐渐分解出磷酸根离子, 磷酸根离子进入到线粒体中与二磷酸腺苷(ADP)结合产生大量的三磷酸腺苷(ATP), ATP分解产物腺苷与膜上A2b腺苷受体结合激活腺苷酸环化酶(AC), 从而促进ATP转化为环磷酸腺苷(cAMP), 最终激活环磷酸腺苷/蛋白激酶 (AcAMP/PKA)信号通路以促进BMSCs的成骨分化. 机理如图1所示, nHA对骨分化分子机制的探讨为其临床应用提供了理论依据.

　　为了研究nHA对体内骨修复的作用, 研究工作者建立了系统、科学的分析方法用于评价nHA对骨细胞分化、骨修复及骨再生的能力. Zhu等人[19]建立了新西兰大白兔双桡骨缺损模型, 对比植入nHA材料和不植入组对骨修复的影响, 结果显示, nHA的植入促进了骨愈合能力, 且在诱导骨性上有统计学差异. 另一个体内研究实例是将nHA和微米级别的HA移植到骨缺损位点, 3~12周后发现两者诱导的骨形成和血管生成潜能与小梁骨相当, 没有显著性差异. 但是, 12周后移植nHA材料的部位可观察到明显的骨内生长. 上述研究证明nHA能够模拟骨小梁, 在整形外科手术应用中具有巨大的潜力. 但是, 传统单一的HA 机械性能较差, 主要表现在临床应用中承载力低, 这便极大地限制了它的应用范围[20].

　　1.2 HA/聚合物/细胞因子复合材料

　　传统的HA具有机械性能差、脆性高、韧性差等缺点, 为了改善其力学性能, Bonfield等人[21]受到天然骨有机成分可增强无机成分机械性能的启发, 最先提出了生物陶瓷/聚合物复合材料的概念, 在HA中掺入聚苯乙烯制备出类似骨基质的HA复合材料. 该材料显著提高了HA的机械性能, 增加了韧性及生物活性. 另外, HA中掺入可降解聚合物, 如胶原纤维、蚕丝蛋白、聚乳酸、凝胶、壳聚糖等制备出的HA/复合材料已经进入临床前期的研究阶段. 每种聚合物的性能不同, 对于改善HA机械性能的程度也有所不同[22]. 胶原蛋白是天然骨组织中最丰富的聚合物蛋白, HA中掺入胶原蛋白为细胞提供更多的活性位点, 提升材料的可降解性, 进而加快新骨的再生. 然而, 由于胶原蛋白存在潜在的抗原性和病原体传染性, 而且成本较高, 因此限制了它的应用范围[23]. 明胶作为胶原蛋白的替代物, 具有多个整合素位点, 它没有免疫原性, 对细胞的黏附起到关键作用. 此外, 支架材料上负载骨形态发生蛋白2(BMP2)和表皮生长因子等对于提高骨诱导性和局部血液运输性能起到良好的促进作用[24~26]. 有学者提出锶(Sr)元素可能在骨骼发育和骨修复中发挥重要作用[27~29], 近年来引起了众多学者的兴趣和关注. 目前, Sr被掺杂入许多生物活性材料中, 弥补了现有生物活性材料在成骨诱导性和降解性等方面的不足, 实现了骨修复生物材料的多功能性, 在骨组织工程与再生医学中得以广泛应用. Hao等人[30]采用化学沉淀法合成了一种粒径在600~800 nm的锶掺杂纳米羟基磷灰石(nano-SrHA), 与nHA相比, 100 μg/mL nano-Sr-HAP (锶/磷的摩尔比1.67)显著增强了成骨细胞黏附、增殖和细胞活力, 而且增强了MSCs细胞的ALP活性, 是nanoHAP组的2.18倍, 证实锶具有骨诱导的特性. 结果表明在纳米羟基磷灰石中引入锶元素后, 其性能得到明显改善, 可以用于修复骨质疏松性骨折引起的骨缺损. 本课题组[31]之前采用仿生矿化的方法在聚乳酸多孔支架的表面沉积掺锶的nHA(掺杂Sr的比率为 20%), 通过沉积Sr-HA有效改善聚乳酸的疏水性, 缓解聚乳酸降解产生的酸性, 并且通过掺入Sr来增加聚左旋乳酸(PLLA)的成骨性能, 其成骨性能为单一 PLLA的2.04倍(图2).

　　生物陶瓷/生物聚合物复合材料具有较好的孔隙率, 较优的力学性能和生物特性是人工骨材料的理想选择[32]. 近年来, 纳米壳聚糖复合生物材料在组织工程与再生医学应用引起广泛的关注. 与单一的壳聚糖支架相比, nHA/壳聚糖复合支架的孔隙率高达95%, 孔径为20~60 μm, 且具有良好的生物相容性[33]; 另外, nHA/壳聚糖复合材料具有良好的矿化能力, 表现在形成稳定的HA, 且促进细胞ALP的表达[34]. 文献报道, nHA/壳聚糖纤维支架能够诱导 BMSCs的成骨分化, 并促进MSCs的黏附和增殖, 在分子水平上, 上调成骨相关基因表达, 如I型胶原蛋白、ALP、骨钙素、骨涎蛋白等基因[35]. Tang等人[36] 研究认为天然HA/壳聚糖复合材料能够与硬骨组织很好地相容, 并诱导骨形成, 因此该材料作为骨组织工程与再生医学中的人工骨移植物和支撑材料具有巨大潜力. 另外, Zhang课题组[37]利用静电纺丝技术制备的HA/壳聚糖复合纳米纤维具有类似天然骨纤维结构, 该材料掺入生物聚合物可提高材料的机械性能, 而nHA的掺入有助于成骨细胞的黏附和增殖. 体内研究同样证明了nHA促进骨的形成与再生[38]. Fricain等人[39]对比掺杂或不掺杂nHA的具有直链结构的天然淀粉和葡聚糖的骨修复潜能. 结果显示, 掺入nHA的复合物支架诱导形成磷灰石层, 有利于形成皮下致密组织、致密矿化物及骨移植位点早期骨的再生. 另一个异位移植的研究表明在功能化的多孔纳米磷酸钙/钛合金支架上接种骨膜细胞, 并将其移植到骨缺损部位, 可以观察到大量的新骨生成[40]. 除此之外, 将干细胞及生长因子与nHA预培养, 然后将其移植到兔颅骨缺损模型中, 结果发现, 经过移植 6和12周后观察到29.45%和44.55%新骨区的形成. 因此, 将干细胞特别是人骨髓间充质干细胞(骨再生的金标准)预培养在nHA支架上能够极大的提升骨再生, 并已经成功应用到临床. 刘昌胜团队[41]在钙磷基纳米材料上有着深厚的研究, 认为磷酸骨钙水泥(CPC) 作为不同形式磷酸钙的混合物同样对骨修复行为有重要的影响. 刘昌胜课题组[42]报道了由无水磷酸四钙和磷酸二钙混合而成的CPC能够与HA晶体形成水合物, 该材料具有较低结晶度和较高的水溶性, 使 CPC纳米晶体具有较好的机械性能和较高的生物吸收性能, 促进相关成骨细胞体内矿化及HA/胶原蛋白基质的形成. 该团队报道的CPC首次运用在国内临床上. 此外, 该团队的另外一项研究认为多孔β-磷酸三钙(β-TCP)具有较好的生物相容性和骨传导性, 但缺乏稳定的结构和机械性能, 限制了其在骨修复中的应用. 基于此问题, 该团队将β-TCP与生物可降解 的聚乳酸(PLA)和聚己内酯(PCL)杂合形成β-TCP/ PGS介孔支架材料, 该支架具有多孔互通结构和较好的机械性能, 提高了相关骨细胞的穿透性、增殖能力及矿化能力.

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