环介导等温扩增法在食品安全检测领域的应用

　　摘要：近年来各类型食品安全事件频发，社会上下对于食品安全问题也愈发重视。根据各类型食品安全事件来看，食源性致病菌是引起食品安全问题的主要因素。目前在我国检测食源性致病菌的主要手段为细菌分析、培养、生化鉴定等工作，该方法操作周期较长，并且检测手段十分繁琐，在检测过程中往往只能检测一种病菌，并且得出检测报告的时间长达4~7d，基于此新型食源性致病菌检测手段的研究至关重要。等温扩增法在此情况下诞生，该方法因为对仪器要求不苛刻，核酸扩增高效、特异性好等优点迅速成为食品安全行业食源性致病菌的检测手段。文章从环介导等温扩增法技术原理到其与新技术（包括横向试纸法（Lateralflowdipstick,LFD），表面增强拉曼光谱（surface-enhancedRamanscattering,SERS），微流控芯片技术（micro-fluidics,MF））结合方法在微生物快速检测领域的应用进行论述，并对其在微生物快检方面的前景进行展望。

　　关键词：等温扩增法；致病菌；微生物快检

　　根据世界卫生组织的相关调查可知，有关食品中的有害病源微生物等高达200余种，每年在全球范围内大约200多×104人的死亡都与食品安全有关，其中食源性致病菌是导致各种食品安全问题的主要原因。在我国，虽然没有专门针对食源性致病菌的诊断与报告，但是根据食品安全事故的发生情况来看，每年大约有4800×104人都会因为食品问题前往医院进行诊治，其中超过12×104的患者会因为食品安全入院治疗，3000余人会直接死于食源性疾病，由此可见,食源性致病菌的危害不可小觑,对于食源性致病菌的快速检测技术普及尤其迫切，等温扩增法因为对仪器要求较低，已广泛应用于DNA扩增的检测和诊断。例如，许多病原体，如病毒、真菌、细菌和寄生虫都可以使用LAMP进行检测，其他生物源，如转基因动植物都可以作为LAMP的检测对象。其具备核酸扩增高效、特异性好等优点有望成为食品安全行业食源性致病菌的重要检测手段。

　　1技术原理

　　环介导等温扩增(Loop-mediatedistemperatureamplification,LAMP)是一种简单、快速的方法，不需要昂贵的设备即可扩增和检测目标序列，只需要一个温度控制的加热块或水浴进行等温放大反应，需要采用一对外引物和一对内部引物，对目标基因的6个特定区域进行识别，然后利用BstDNA聚合酶在恒温条件下参与反应以完成目的基因的扩增。在目标序列当中，2个引物能够组成一个互补序列，并且组成的互补序列会形成可哑铃状结构，使得扩增产物呈现指数增长，在此过程中，通过添加2个额外环引物的方式，加快该反应的进行。

　　2等温扩增法的衍生技术应用现状

　　通常对LAMP扩增产物传统检测方法包括肉眼观察、凝胶电泳分离显色法、实时浊度、实时荧光等，相比新方法，传统方法具有灵敏度低或存在抑制放大现象等弊端，因此新的LAMP扩增产物检测技术应用研究越发广泛。如横向试纸法、表面强度拉曼、微流控芯片技术等。

　　2.1横向试纸法（Lateralflowdipstick,LFD）

　　LFD主要采用的是胶体金作为标记物，借助核酸等温扩增技术快速、便携等优势，核酸等温扩增-LFD技术在病原微生物的检测，天津市疾控预防中心研究者将环介导等温扩增与横向扩增相结合流试纸用于检测布鲁氏菌，并建立了一个快速布鲁氏菌快速检测方法。总程序时间仅需80min即可特异性检测布鲁氏菌，对纯菌培养的检测灵敏度达到5.4x100CFU/mL。LAMP-LFD方法能够快速、特异地检测布鲁氏菌，且具有简便、经济、直观的优势。

　　早在2014年，宁波大学生物与海洋科学系王瑞娜等为了减少全球水产养殖业严重的经济损失，建立了基于环介导等温扩增和侧流联合的猪链球菌视觉检测试纸方法，该研究采用LAMP-LFD快速检测猪链球菌，整个检测过程仅需40min，比常规PCR检测时间缩短了2h。对猪链球菌纯菌的检出限为8.70x101CFU/mL(1.74CFU/reaction)。比LAMP高10倍，比常规PCR高100倍且具有良好的重复性。因此，LAMP-LED是一种准确、省时、简便的检测方法，可用于现场检测。

　　刘露及农业部淡水渔业健康养殖重点实验室等多个研究团队建立了环介导等温扩增联合横向流动试纸条检测草鱼呼肠孤病毒的方法，并与实时荧光定量PCR（qPCR）技术进行对比。从LAMP扩增到LFD结果判读共需50min，比qPCR检测缩短近1h。

　　以上研究表明，LAMP和物美价廉的试纸条结合检测致病菌不仅解决了单独使用LFD灵敏度较低的缺点，也更加突出了核酸等温扩增技术快速、方便的优势。LAMP-LFD技术在致病菌检测领域发展迅速且涉及面广使得LAMP-LFD技术受到越来越多专业人士的青睐，其进一步的研究开发依然非常迫切。

　　2.2表面增强拉曼光谱（surface-enhancedRamanscattering,SERS）

　　表面增强拉曼光谱是使用拉曼活性金纳米探针检测细菌的DNA。结合LAMP扩增目标DNA，用金纳米粒子组成的金纳米探针进行标记，用特异性的探针修饰，使SERS能够检测到目标DNA。

　　ShehataDM等研究人员开发了一种集成的检测方法，将环介导的等温扩增(LAMP)和表面增强拉曼光谱(SERS)结合起来检测沙门氏菌，此检测方法的灵敏度比传统的PCR方法高100倍。值得注意的是，这项技术可以对肠道链球菌的目标DNA进行高度特异性检测，并将其与密切相关的细菌或非特异性污染的DNA区分开来，使其比标准LAMP技术更准确可靠，同时研究验证了LAMP-SERS法在牛奶样品中检测肠杆菌的适用性。LAMP-SERS具有较高的特异性和敏感性，在快速检测不同食源性致病菌和其他微生物污染物方面有极大的潜力。

　　2.3微流控芯片技术（micro-fluidics,MF）

　　微流控芯片是一种在20世纪80年代兴起的能够精准操做控制的微尺度流体技术。其将化学分析仪器微型化与集成化，尽可能地把分析设备的功能聚集到芯片上。

　　JUHepeng等人建立LAMP微流控芯片快速检测沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的方法。用仪器或肉眼对结果进行评估，用标准菌株测试了芯片的敏感性和特异性，用污染样品对芯片的敏感性进行了第二次验证。结果表明，该芯片具有较高的灵敏度和特异性，三种病原菌检测灵敏度均可达到102CFU/mL。药科大学生命科学与技术学院研究者通过设计芯片结构、优化进样模式及检测方式，实现了病原微生物核酸提取、扩增与检测一体化，并具备多重检测、定量检测等功能。以期为病原微生物的快速筛查提供更多的方案思路，提升公共卫生领域对传染性疾病的防控能力。

　　朱亚光与其同事探讨恒温扩增微流控芯片技术快速筛查关节结核感染的应用价值，应用恒温扩增法和传统培养法对19例疑似关节结核感染患者标本进行菌群鉴定，借助共焦滤波技术，荧光染料技术将标本的核酸通过恒温扩增法使结果量化，同时将标本核酸结果比对阴性对照，阳性对照的核酸结果以此鉴定结果准确性。结果显示恒温扩增法检测出13例阳性样品，阳性率为68.42%；传统培养法检测出7例阳性样品，阳性率为36.84%；由此得到恒温扩增微流控芯片荧光检测核酸技术可快速、准确、简便地检测可疑关节结核中结核分枝杆菌复合群，可作为诊断筛查手段。

　　秦奎伟将环介导等温扩增的微流控芯技术应用在病原微生物沙门氏菌的快速检测鉴定中，成功实现了对沙门氏菌的快速检测鉴定。其研发的新型环介导等温扩增微流控芯片具备体积小、耗样量少、分析快、反应条件温和、可视化检测等优点，可为食源性病原菌的快速检测提供一种理想的方法。

　　3环介导等温扩增技术在检测领域应用前景

　　目前，LAMP技术已经被应用于多种真菌、病毒、细菌以及分枝杆菌等病原微生物的诊断。该方法操作简单，仪器设备依赖性低，可快速、特异地检测出病源微生物，尤其是LAMP-SERS分析具有较高的特异性和敏感性，具有快速检测不同食源性致病菌和其他微生物污染物的潜力。微流控芯片技术是使用微管道进行实验反应和样本检测等，具有微型化、集成化等特点。根据通道的设计，可以在芯片上产生所需的微环境条件，利用微流控芯片技术可以实现短期内数十甚至上百例样本的同时鉴定。LAMP技术结合一些新技术改变了传统检测方法中的诸多不足，有望成为微生物现场快速检测的常规技术手段。

　　参考文献：

　　[1]李秀梅,梁智选,李颖,等.环介导等温扩增技术与横向流动试纸条法快速检测布鲁氏杆菌[J].食品与生物技术学报,2017(12):50-56.

　　[2]刘露,李伟哲,肖勤.环介导等温扩增联合横向流动试纸条检测草鱼呼肠孤病毒方法的建立[J].河北农业大学学报,2018,41(02):99-104.

　　舒沿沿，郑菲

《环介导等温扩增法在食品安全检测领域的应用》

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