不同分离源植物乳杆菌的群体基因组分析

　　摘要：【背景】植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)广泛存在于植物、乳制品、肉制品、哺乳动物和昆虫的肠道等多种生态环境中。【目的】探究不同分离源L.plantarum基因组与其所在环境是否存在潜在的联系。【方法】利用比较基因组学对126株分离自植物、乳制品、肉制品、果蝇及哺乳动物肠道和口腔等部位的L.plantarum菌株基因组进行系统发育分析和功能基因组分析，解析不同分离源菌株间的亲缘关系和进化历程。【结果】果蝇分离株的基因组大小显著高于植物、哺乳动物肠道、肉制品和乳制品分离株(P0.05)。基于单拷贝基因串联和核心基因系统发育树分析均发现，果蝇分离株和乳制品分离株分别集中聚集分布在某一分支中，其余分离源均匀分布在各个分支中。附属基因分析结果与系统发育树分析结果一致。功能基因注释结果发现，果蝇分离株的环境特异性基因参与低聚果糖和几丁质代谢，乳制品分离株的环境特异性基因参与mazEF毒素-抗毒素系统和CRISPR系统。【结论】植物乳杆菌分离株为适应较为独特的果蝇和乳制品生境而发生了适应性进化。本研究为植物乳杆菌适应性进化提供了新见解，同时为解析菌株的进化历程提供了理论基础。

　　关键词：植物乳杆菌，分离源，群体基因组

　　植物乳杆菌是一种兼性异型发酵的乳酸菌，广泛存在于植物、乳制品、肉制品和胃肠道等多种生态环境中[1]，具有维持肠道内菌群平衡、降胆固醇、降血脂和促进机体生长等多种益生功效，应用于食品工业及医疗保健等多个领域[2-5]。植物乳杆菌具有较高的经济价值，解析其基因组特征有助于在生产工业中的应用。

　　1材料与方法

　　1.1实验菌株

　　测定的2株菌来自内蒙古农业大学乳酸菌菌种资源库(Lacticacidbacteriacollectioncenter，LABCC)，分别为分离自蒙古前杭盖海尔汗苏木酸驼奶中的IMAU20970和分离自甘肃甘南州玛曲县阿尼玛乡酸牦牛奶中的IMAU80873。124株菌株基因组均下载自NCBI的GenBank数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)，它们具有明确的分离源，测序质量较好，菌株具体菌株信息如表1所示。

　　126株菌按分离源划分为6组，其中39株为植物分离株，9株为果蝇分离株，22株为哺乳动物肠道分离株，9株为哺乳动物口腔等部位分离株，18株为肉制品分离株，29株为乳制品分离株。

　　1.2主要试剂和仪器

　　基因组DNA提取试剂盒，北京天根生化科技有限公司；MRS培养基，Oxoid公司。电热恒温培养箱，北京一恒科技有限公司；超微量紫外分光光度计，NanoDrop公司。

　　1.3菌株培养与基因组

　　DNA的提取将冻干菌粉取适量接种于5mLMRS液体培养基中，在37°C下静置培养24h，按2%接种量接种于5mL液体MRS培养基中，继代培养3代，3000r/min离心10min收集菌体。采用基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA，操作步骤按照试剂盒说明书进行，使用超微量紫外分光光度计检验DNA样品的纯度和质量。

　　1.4基因组测序和组装

　　基因组DNA提取后进行质量鉴定，在浓度和纯度达到测序要求后由上海美吉生物医药科技有限公司进行全基因组测序。采用IlluminaHiSeq4000测序平台完成全基因组测序，参照文献[13]构建文库，每株菌分别构建PE150的文库。将获取的原始数据进行质量评估，经过低质量Reads的过滤、去除接头和引物后，获得高质量的Reads序列，然后运用软件SOAPdenovoV1.06[14]对高质量的Reads进行拼接，采用GapCloser[15]软件对内部的Gap进行填充和单个碱基的矫正，最终完成基因组的组装。

　　2结果与讨论

　　2.1基因组基本特征分析

　　测定的菌株IMAU20970组装后得到251个Scaffolds，基因组长度为3341.7kb，编码3184个基因，(G+C)mol%含量为44.7%；IMAU80873组装后得到157个Scaffolds，基因组长度为3193.8kb，编码3072个基因，(G+C)mol%含量为44.5%。两株菌的基因组大小和编码基因数量与其他乳制品分离株基本一致。126株植物乳杆菌的平均基因组大小为3284.3±125.6kb，平均编码基因数量为3017.8±148.3个，平均(G+C)mol%为44.5%±0.2%。通过比较不同分离源基因组大小和编码基因数量发现(图1)，果蝇分离株的基因组大小显著高于植物、哺乳动物肠道、肉制品和乳制品分离株(P0.05)。植物乳杆菌生长环境的高度多样性被认为与其拥有较大基因组有关[21]。较大的基因组可能编码更多参与代谢和胁迫耐受能力的基因，使其具有较强的环境适应能力[22-23]。果蝇作为昆虫类动物，其饮食结构和所在的生存环境可能与其他分离源不同，果蝇分离株具有较大的基因组和较多的编码基因可能是为了适应果蝇这种独特的宿主环境而发生了适应性进化。

　　2.2基因组单拷贝基因串联和核心基因系统发育比较分析

　　基于138个单拷贝基因串联系统发育树结果如图2所示，系统发育树共分为三大分支，分别为A、B和C分支。分支A中包括18株乳制品分离株(占乳制品分离株的62.1%)，本实验测定的2株乳制品分离株均分布在该分支中，16株植物分离株(占植物分离株的41%)，1株果蝇分离株，其余菌株分离自肉制品、哺乳动物肠道和哺乳动物口腔等部位；分支B包括6株果蝇分离株(占果蝇分离株的66.7%)，17株植物分离株(占植物分离株的43.6%)，11株肉制品分离株(占肉制品分离株的61.1%)，4株乳制品分离株，其余菌株分离自哺乳动物肠道和哺乳动物口腔等部位；分支C包括7株乳制品分离株，2株果蝇分离株，其余不同分离源的菌株混合分布在该分支中。

　　3结论

　　本研究对来自不同分离源的126株植物乳杆菌的全基因组序列进行了比较基因组学分析。结果发现，果蝇分离株基因组大小和基因数量显著高于植物、肉制品、乳制品、哺乳动物肠道和其他部位分离源。基于单拷贝基因串联和核心基因系统发育树分析均发现，果蝇和乳制品分离株分别集中分布在某一分支中，其余分离源均匀分布在系统发育树各个分支中。附属基因分析结果与系统发育树分析结果一致。功能基因注释结果发现，果蝇分离株的环境特异性基因参与低聚果糖和几丁质代谢，乳制品分离株的环境特异性基因参与mazEF毒素-抗毒素系统和CRISPR系统。本研究发现果蝇和乳制品分离株存在环境特异性，而其他分离源菌株没有呈现明显的环境特异性。果蝇和乳制品的环境与其他分离源相比可能较为独特，果蝇和乳制品分离株可能为了适应自身的生长环境发生了适应性进化。本研究结果为了解植物乳杆菌的进化历程提供了参考。

　　REFERENCES

　　[1]SiezenRJ,vanHylckamaVliegJET.GenomicdiversityandversatilityofLactobacillusplantarum,anaturalmetabolicengineer[J].MicrobialCellFactories,2011,10Suppl1:S3

　　[2]ZengD,TangYR,NiXQ,etal.StudyontheeffectsofLactobacillusplantarumF22onliverandintestinalmicroflora[J].ActaNutrimentaSinica,2010,32(4):370-374(inChinese)曾东,唐雨蕊,倪学勤,等.植物乳杆菌F22对肝脏和肠道微生物菌群的影响研究[J].营养学报,2010,32(4):370-374

　　[3]ConnellyP.Lactobacillusplantarum-aliteraturereviewoftherapeuticbenefits[J].JournaloftheAustralianTraditional-MedicineSociety,2008,14(2):79-82

　　[4]BaoY,WangZL,ZhangY,etal.EffectofLactobacillusplantarumP-8onlipidmetabolisminhyperlipidemicratmodel[J].EuropeanJournalofLipidScienceandTechnology,2012,114(11):1230-1236

　　[5]GaoPF,MaC,SunZ,etal.Feed-additiveprobioticsaccelerateyetantibioticsdelayintestinalmicrobiotamaturationinbroilerchicken[J].Microbiome,2017,5:91

　　刘亚华李伟程余中节赵飞燕赵洁孙志宏张和平*

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