间充质干细胞临床前安全性研究概况

　　间充质干细胞(MSC)于 1974 年被第一次定义，而后在 20 世纪 90 年代得到推广[1]。2006 年，细胞疗法国际协会针对细胞表面阳性标志物为 MSC 建立了一个最低标准，即 CD90+ 、CD105+ 、CD73+ 、CD45– 、CD34– 、CD14– 、 CD79– 、HLA– 、DR–[2]。最初的临床试验中，MSC 主要是用于成骨不全[3]或黏多糖症的研究。近年来研究表明，MSC 也具备促血管生成、免疫调节、抗炎、营养支持等生物活性，这为其用于缺血性、炎性疾病等方面的治疗提供了可能性[4]。另外 MSC 在实验中易于获得、可在体外大量扩增及有多系分化潜能的性质也表明其可成为组织工程的一个强有力工具[5]。

　　1 治疗机制及研究进展

　　临床前研究表明，MSC 一般通过自身分化、营养支持、免疫调节等机制发挥治疗作用[6]。间充质干细胞可由一系列组织分离得到，同时在一定条件下可分化成不同的祖细胞，如成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞以及造血支持基质细胞，这些细胞进一步可分化为心肌细胞、神经细胞等。同时， MSC 可通过自分泌或旁分泌途径释放细胞因子，这些活性物质可定向聚集于特定部位起到抑制细胞凋亡、纤维化，促进血管生成或缓解炎性反应等作用[7]。另外，MSC 在体内可通过免疫调节来调节机体的免疫系统，借此治疗一些炎性疾病。最新研究表明，干细胞可能并没有免疫豁免的机制，其可能是通过免疫逃逸机制来实现相关治疗作用的[8]。

　　MSC 虽然在很多领域展现出极大潜力，但现今的研究仍面临很多挑战。临床试验虽然正在大力进行，但数据仍较为缺乏。临床前研究中，动物模型、干细胞来源、体外培养条件的优化选择目前都没有一个明确的规定。不同来源的人源干细胞分泌的细胞因子、分化方向也有很大差异。

　　2 安全风险因素

　　由于细胞自身生物学或实验操作等各种因素，干细胞在应用于临床或基础实验的过程中存在一定安全风险，主要可分为内源性风险、外源性风险及其他生物风险。

　　内源性风险主要包括：①干细胞肿瘤形成相关风险。干细胞具有不断增殖、对凋亡诱导不敏感等与肿瘤细胞相似的生长调控机制。有研究表明，胚胎干细胞(ESC)和诱导多能干细胞(iPSC)可引发良性或恶性的畸胎瘤，同时有研究表明高代次的鼠源 MSC 可自发恶性转化。干细胞也可能影响体内已存在的肿瘤细胞的生长和扩增，即干细胞的“促瘤性”[9]。②干细胞免疫学相关风险。实验中需要考虑细胞的免疫原性和免疫调节性质带来的生物学风险。ESC 未分化前的免疫原性很低，但在分化后由于 MHC 分子的表达可表现出较高的免疫原性。同时体外实验表明，ESC 和 MSC 可通过调控 T 细胞、单核细胞及 NK 细胞等的增殖分化来调节生物免疫能力。③干细胞由于自身携带的传染性疾病、未知或罕见的病原体、遗传性疾病等而产生的风险。外源性风险主要包括：细菌、真菌、支原体及病毒污染[10]，一般来自于实验操作、细胞库污染和动物基质细胞污染等方面[11]。与内源性风险相比，外源性风险污染途径多，防控更为复杂。

　　另外由于干细胞的体内归巢和分化机制仍不明确[12]，干细胞进入机体内可能存在非靶向部位转移、目标以外的分化或去分化等风险。同时当大剂量的细胞被注射进入体内，可能阻塞在注射区域，严重的可导致注射区域组织坏死等情况。

　　3 临床前安全性研究概况

　　MSC 临床前安全评价一般分为两部分：一般毒性评价和干细胞特定安全评价。一般毒性评价包括行为观察、临床症状、血液生化测定、死亡率、组织病理检查等。干细胞特定安全评价包括致瘤性、生物分布等。其中一般毒性评价和一般生物制品的评价方式相似。另外目前针对干细胞特定的安全评价也已有一定的研究，但仍缺乏专门针对干细胞评价的相关文件规范进行指导。

　　干细胞安全评价实验设计中需考虑动物模型、给药途径、实验周期等相关因素。①动物模型：考虑到异种排斥，建议选择免疫缺陷或免疫抑制类动物，如 NOD/SCID 小鼠、nu/nu 小鼠等，但也需考虑到该类动物寿命较短(12 ~ 18 个月)，且可能产生自发肿瘤影响实验结果[13]。同时也有研究选择食蟹猴、狒狒等非人灵长类动物，这类动物模型存在数据采集困难、需进行免疫抑制操作等缺点。②给药途径：尽量和临床保持一致，实验中采用的给药途径主要有静脉注射、皮下注射和肌肉注射等方式。③实验周期：依据实验目的和动物种类的不同，需制定不同的实验周期。免疫缺陷的啮齿类动物的实验周期自 8 d ~ 8 个月不等，但需考虑到超过 6 个月时动物可能产生自发性肿瘤，影响实验进程和结果。目前采用食蟹猴为动物模型的评价实验主要是在一般毒性研究，实验周期从 4 ~ 6 周不等。④细胞剂量：研究报道 MSC 输注患者所需细胞数为(1.0 ~ 2.0)× 106 cells/kg[14]，动物实验中则需依据不同动物种类换算得出具体的细胞剂量。

　　3.1 一般毒性

　　目前已有多项研究进行了 MSC 的一般毒性实验。 Creane 等[15]单次肌肉注射骨髓来源 MSC 至免疫缺陷小鼠，3 个月的实验周期内未见实验动物的体重、饮食、病理学等相关指征变化。Ramot 等[16]以 NOD/SCID 小鼠为模型，通过单次或 3 次肌肉注射胎盘来源 MSC 进行了为期 3 个月的毒性反应试验，未出现明显不良反应症状。Ra 等[17]通过单次尾静脉注射脂肪来源 MSC 至 SCID 小鼠， 13 周内高剂量下(2.5 × 108 cells/kg)未见明显毒性反应。海泉等[18]以小鼠、大鼠、裸鼠为评价模型，考察人源 UC-MSC 进入动物体内后的急性毒性反应和长期毒性反应。急性实验中细胞剂量可达 1.25 × 108 cells/kg，长期毒性实验中细胞量为 2.5 × 106 ~ 1 × 107 cells/kg，该实验表明干细胞不会导致明显毒性反应。王冠华等[19]以 ICR 小鼠为动物模型，通过单次尾静脉给药评价 MSC 的急性毒性反应。结果表明，MSC 无明显的毒性反应，但在肺脏和脾脏等部位有滞留。另外也有一些研究选择食蟹猴为动物模型，给药周期为 4 ~ 6 周，给药途径为单次或多次静脉注射、脑内注射等[20]。一般检测指标主要包括：行为、体重、体温、心电图、血细胞计数、凝血功能、血液、尿液等。

　　3.2 生物分布

　　生物分布关系到细胞在各组织脏器中的迁移、聚集、分化等情况。研究表明，干细胞移植入体内后的迁移情况同细胞的来源、传代次数、培养条件、植入方式、细胞因子及其受体相关[21]。有研究表明，MSC 移植到体内后可聚集到特定的损伤组织通过分泌相关因子发挥作用[22]，但也有研究表明由于干细胞的大体积和表面黏附受体，大多数 MSC 可阻塞在肺部形成栓塞[23]，鉴于目前对干细胞在体内分布的情况和危害仍不清楚，进行相关研究具有重要意义。

　　目前干细胞生物分布研究主要是细胞进行体外标记后再移植入体内，其中主要标记方式有荧光素酶[24]、绿色荧光蛋白(GFP)、增强型绿色荧光蛋白(eGFP)、近红外染料标记[25]等。相应地出现了包括生物发光成像、单光子发射 CT 扫描、磁共振成像等检测方法。同时通过 PCR、流式检测干细胞表面标志物等方法也可以对生物分布进行动态监测。生物发光或磁共振成像属于活体成像技术，这项技术可减少动物使用数量和实验解剖工作量。而在一些实验周期较短的研究中则可采用染料(如：近红外荧光色素等)染色的方法进行研究。

　　3.3 致瘤性

　　干细胞一般可分化成三类肿瘤：畸胎瘤、畸胎癌和继发性肿瘤[26]。研究表明干细胞和肿瘤细胞具有很多相似的特性，例如凋亡抵抗特性、自我复制能力和相似的生长调控机制。实验动物模型方面，由于人源干细胞在动物身上进行实验时可能会有免疫排斥反应，所以在致瘤性实验中通常采用免疫缺陷小鼠(如 NOD/SCID 小鼠、裸鼠等)，这类动物由于缺乏免疫系统往往更易产生自发肿瘤。聂德志等[27]将神经干细胞和 MSC 移植入 BALB/c 裸鼠体内进行为期 12 周的致瘤性实验，结果显示短期传代后的干细胞没有致瘤性。秦秀军等[28]则考察了脂肪间充质干细胞在裸鼠体内 6 个月的致瘤性情况，也未发现干细胞的致瘤倾向。Ra 等[17]在 BALB/c-nu 上进行了为期 26 周的致瘤试验，单次皮下注射 2 × 108 cells/kg 条件下试验周期内未见肿瘤形成。但同样有研究发现尾静脉注射 MSC 至免疫抑制小鼠体内，可导致肉瘤产生[29]。所以需要进一步的实验数据来得到致瘤性结论。

　　4 结语

　　目前，MSC 在诸多领域都展现出极大的应用前景，但其安全性相关的数据和文件仍比较欠缺[30]，其生物分布、致瘤性和免疫原性等特定的安全评价试验均有别于其他生物制品，研究中应在一般毒性实验的基础之上，纳入细胞评价的相关安全性评价指标，力求全面完整地对间充质干细胞的安全性进行评价。

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