丹参根不同组织部位丹参酮类成分分布的拉曼光谱研究

　　摘要：采用拉曼光谱法对药用植物丹参根鲜样不同组织部位进行原位检测，以考察丹参酮类成分在丹参根中不同组织上的分布。结果表明：丹参酮IIA标准品在1668、1620、1579、1535、1479cm-1出现较强峰，丹参根周皮、韧皮部也在1667/1665、1618/1613、1576/1575、1533/1532、1477/1480cm-1出现较强峰，周皮、韧皮部与丹参酮IIA标准品谱图之间的匹配度分别为74.9%、49.4%;而木质部与丹参酮IIA标准品无相对应的拉曼峰，与隐丹参酮、二氢丹参酮标准品谱图之间的匹配度很低，分别仅为4.4%、5.6%，不足以证明有丹参酮类成分存在;因此得出丹参根周皮和韧皮部中均有丹参酮类成分的分布，且主要成分为丹参酮IIA，而木质部中无丹参酮类成分分布的结论。虽然丹参根周皮和木质部均呈红色，但拉曼光谱检测发现丹参酮类成分的分布与周皮细胞颜色分布之间呈正相关性，与木质部细胞颜色分布无相关性，这提示颜色判别法分析丹参酮类成分的分布具有一定的局限性，而利用拉曼光谱法可快速的获得丹参酮类成分在丹参根中的分布情况，凸显了拉曼光谱用于丹参根中化学成分原位检测的优势。

　　关键词：丹参根;拉曼光谱;原位检测;丹参酮类成分

　　1引言

　　中药丹参是唇形科植物丹参(Salviamiltior-rhizaBge.)的干燥根及根茎，具有活血化瘀、通经止痛、清心除烦等功效，在临床上被广泛用于心脑血管疾病的治疗[1]。丹参中主要的活性成分包括脂溶性成分和水溶性成分，其中丹参酮类成分是丹参中主要的脂溶性成分，为心脑血管疾病治疗的主要药效物质[2]，在丹参植物体内的合成与积累具有固定的部位[3]。常用的测定丹参根中丹参酮类成分的方法是高效液相色谱法(HPLC)[4]和液相色谱串联质谱法(LC-MS)[5]，这些方法需要复杂的样品制备和提取过程，且难以表现不同组织部位化学成分的空间分布特征。本文利用拉曼光谱技术对药用植物丹参根部不同组织部位的丹参酮类成分进行原位、快速分析，以考察丹参酮类成分在不同组织部位中的分布情况，为进一步对丹参酮类成分的积累规律和生物合成研究提供支撑。

　　2实验部分

　　2.1仪器设备

　　DXR激光共焦显微拉曼光谱仪(DXRRamanMicroscope，ThermoFisherScientific公司)，激发波长780nm，激光能量24mW，采集曝光时间3s，样品曝光次数30，针孔光阑50!m，50倍物镜(数值孔径0.5!m)，光谱采集范围为200～3200cm-1，光谱分辨率为4cm-1。

　　2.2样品来源与制片

　　样品丹参来源于四川中江，种植于成都中医药大学药用植物园内。取样后，洗净、用徒手切片法切薄片(厚度约1mm)，蒸馏水装片，供拉曼光谱检测。另取同部位，切约0.1mm薄片，在光镜下确定横切面各细胞组织的分布。

　　2.3丹参酮类标准品

　　丹参酮类标准品丹参酮IIA、丹参酮I、隐丹参酮、二氢丹参酮等均购自于成都普菲德生物技术有限公司，纯度≧98%。

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　　【摘 要】目的建立检测注射用丹参酮ⅡA磺酸钠中内毒素的试验方法。方法运用干扰初筛法对供试品进行干扰试验，采用鲎试剂法对样品中的内毒素进行检测。 结果注射用丹参酮ⅡA磺酸钠在药液稀释浓度为0.016 8 mg·ml-1以下时，与鲎试剂反应无干扰。结论所采用的细菌内毒素检查法可用于注射用丹参酮ⅡA磺酸钠的内毒素检查。

　　3结果与讨论

　　3.1丹参酮类标准品的拉曼光谱特征

　　丹参酮类成分属于二萜类化合物，丹参中主要的丹参酮类成分化学结构式见图1;其拉曼谱图见图2，其中图2(a)为丹参酮IIA的拉曼光谱，共有24条谱线，在1668、1620、1579、1535、1479、1427、1402、1283、1206、1191、1072、1027cm-1有明显的拉曼特征峰;图2(b)为丹参酮I的拉曼光谱，共有25条谱线，在1658、1599、1546、1472、1427、1355、1207、1186、1067cm-1有明显的拉曼特征峰;图2(c)为隐丹参酮的拉曼光谱，共有25条谱线，在1682、1617、1581、1458、1414、1370、1298、1193、1164、1139、1027cm-1有明显的拉曼特征峰;图2(d)为二氢丹参酮的拉曼光谱，共有20条谱线，在1682、1626、1561、1467、1417、1363、1350、1293、1182cm-1有明显的拉曼特征峰。早期的红外光谱研究指出丹参酮类成分的特征峰出现在4000～1350cm-1区域内，指纹峰出现在1350～400cm-1区域内，位于1701、1650cm-1等位置的吸收峰为羰基的振动频率，位于1381、1361cm-1等位置的吸收峰为A环上甲基的振动频率，位于1685、1665、1635cm-1等位置的吸收峰为萘醌的振动频率，位于1025cm-1等位置的吸收峰为呋喃环的振动频率[6]。由于红外峰与拉曼峰的互补性，这些红外特征信息可作为判断拉曼光谱中是否含有丹参酮类成分的参考依据。同时用所获得的丹参酮类成分拉曼谱图建立标准拉曼谱图库。结合丹参酮标准品的拉曼特征峰以及与标准拉曼谱图库进行对比，用于研究丹参根中不同组织部位丹参酮类成分的分布情况。

　　3.2丹参根不同组织部位的拉曼光谱检测

　　3.2.1丹参根不同组织部位丹参酮类成分的分布情况

　　将样品置于显微镜下，调焦清楚后将激光聚焦到不同组织部位(见图3)，得到不同组织部位的拉曼光谱，如图4的a、b、c所示。

　　(1)丹参根不同组织的拉曼特征峰分析

　　由图4(a)和4(b)可知，丹参根周皮和韧皮部拉曼特征峰的波数基本一致;与图2对比，发现其与图2(a)十分相似，由图可见，丹参根周皮、韧皮部及丹参酮IIA标准品均在1667/1665/1668、1618/1613/1620、1576/1575/1579、1533/1532/1535、1477/1480/1479cm-1出现较强峰，在1207/1208/1207、1072/1069/1072、1026/1025/1027、699/699/699、520/520/521cm-1出现中等强度的峰，其中1667/1665/1668归属于萘醌的伸缩振动峰，1026/1025/1027归属于呋喃环的伸缩振动峰，其它拉曼峰的产生受丹参酮母核结构上所连接的不同官能团影响[6]，据此可以判断丹参根周皮和韧皮部中有丹参酮IIA的分布，从峰强度来看，丹参根周皮的峰强度大于韧皮部，说明周皮中的丹参酮IIA含量高于韧皮部，与已有的研究结果相符[4，7]。图4(c)表明，丹参根木质部产生的拉曼信息很少，仅出现了1个拉曼峰，且从谱图对应情况来看，没有与丹参酮类标准品相对应的拉曼峰，说明丹参根木质部中可能没有丹参酮类成分的分布。

　　(2)丹参根不同组织的拉曼谱图与标准品谱图对比获得的样品谱图与标准拉曼谱图库进行对比，OMNIC软件计算得出相似度，结果见表1。

　　与标准拉曼谱图库对比结果表明，丹参根周皮、韧皮部与丹参酮IIA标准品谱图之间的匹配度分别为74.9%、49.4%，与隐丹参酮也有一定的匹配度，说明丹参根周皮和韧皮部中有丹参酮类成分的分布，且主要成分为丹参酮IIA。而木质部与丹参酮类成分的匹配度很低，与隐丹参酮、二氢丹参酮标准品谱图之间的匹配度分别仅为4.4%、5.6%，不足以证明木质部中有丹参酮类成分存在，因此得出丹参根木质部中无丹参酮类成分分布的结论。

　　植物次生代谢产物通过次生代谢途径产生，因其特定的生物学功能和固有的细胞毒性而特异性地分布在植物体不同组织部位中[9]。本文利用拉曼光谱法对丹参酮类成分在丹参根中的组织特异性分布研究结果与段增强[10]、赵希贤[8]、李进瞳[11]等利用HPLC、组织化学定位方法研究结果相吻合。另外利用紫外分光光度法和红外光谱法也可以检测丹参酮类成分。应用HPLC、紫外分光光度法来确定丹参酮类成分在丹参根中的分布是一种有效的研究手段，但其工作量大、操作繁琐、耗时耗工，且无法快速获得化学成分与空间分布之间的信息;而组织化学定位法、红外光谱法需要样品处理，且红外光谱法对水等极性物质敏感，不能检测新鲜含水样品。由于激光拉曼光谱具有灵敏度高、检测限低、简便快速、原位检测等优点，且不受水的干扰[12-13]，因而弥补了其不足之处。

　　3.2.2丹参根不同组织细胞颜色与丹参酮类成分分布之间的相关性

　　对不同颜色的周皮细胞进行检测，所得拉曼谱图如图5所示，与丹参酮类成分标准拉曼谱图库对比的结果见表2。对木质部的不同细胞进行检测，所得拉曼谱图如图6所示，与丹参酮类成分标准拉曼谱图库对比结果见表3。

　　由图5可知，周皮细胞颜色呈图5(a)时，在拉曼谱图上显示出较多、较强的特征峰，而细胞颜色过渡至图5(d)时，拉曼谱图中特征峰减少、强度变弱;表2结果表明，图5(a)拉曼光谱与丹参酮类成分之间的匹配度较高，至图5(d)时匹配度逐渐降低。由图6可知，木质部细胞在4000～1350cm-1内均未出现由丹参酮官能团伸缩振动产生的拉曼特征峰;表3结果表明，图6拉曼光谱与丹参酮类成分之间的匹配度较低。综上可知，在丹参根周皮中，丹参酮类成分的分布与周皮细胞颜色分布之间呈正相关性，即周皮中，细胞红色强度越强的部位，丹参酮类成分含量越高;反之，则含量越低;而木质部细胞颜色与丹参酮类成分的分布没有直接的相关性。

　　丹参酮IIA为丹参中主要的脂溶性成分，呈桔红色结晶状;丹参中其它的脂溶性成分大多亦表现为红色。自古以来，丹参药材的颜色性状在药材质量评价中就具有重要的地位，依据“皮丹而肉紫”的评价指标，王海[14]等利用色彩色差计法和HPLC方法判定丹参细胞颜色与丹参酮类成分之间的关系，以期阐释丹参颜色性状鉴别的合理性，结果表明丹参药材表面颜色与其脂溶性成分呈正相关。而本文研究结果显示，丹参酮类成分的分布只在周皮中与细胞颜色呈正相关性，而在木质部中，与丹参酮类成分的分布没有直接的相关性。这提示，颜色法判别丹参酮类成分的分布具有一定的局限性。

　　4结论

　　本研究结合丹参酮类成分标准品拉曼信息以及与标准拉曼谱图库进行对比，从而判断丹参根中不同组织部位丹参酮类成分的分布情况。结果表明，丹参根周皮和韧皮部中均有丹参酮类成分的分布，且主要成分为丹参酮IIA，而木质部中无丹参酮类成分分布。同时，对丹参根周皮和木质中不同细胞进行拉曼光谱检测，发现丹参酮类成分的分布与周皮细胞颜色分布之间呈正相关性，与木质部细胞颜色分布无相关性。因此，拉曼光谱法可以快速、简便、准确地原位检测丹参酮类成分在丹参根不同组织中的特异性分布情况。

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